肝臟靶向性多功能載體的構(gòu)建及其急性肝臟免疫損傷的基因治療.pdf

1、肝臟作為人體最大的內(nèi)臟器官，具有重要的消化和代謝功能，承擔(dān)著分泌膽汁、參與糖、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝過程、分解代謝有毒物質(zhì)的功能。它具有特殊的血液循環(huán)系統(tǒng)，能夠接受來自門靜脈和肝動脈的雙重血液供應(yīng)。肝小葉是肝臟的基本結(jié)構(gòu)單位，肝細胞在其中呈放射狀圍繞中央靜脈排列形成肝板結(jié)構(gòu)，肝板之間是肝血竇。小于100nm的顆粒物可以高效的從血管中進入肝實質(zhì)細胞。肝臟特殊的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)以及其重要的生理學(xué)功能，使得肝臟成為基因治療理想的靶器官。
　　

2、隨著分子和細胞生物學(xué)、病毒學(xué)和免疫學(xué)的不斷發(fā)展，眾多肝臟疾病的分子遺傳發(fā)病機制得以解釋，除傳統(tǒng)的肝細胞移植外，針對眾多遺傳性或獲得性肝臟疾病的基因治療成為重要手段，具有廣泛的應(yīng)用前景。肝臟的基因治療面臨的最大難題是如何高效安全的將治療基因?qū)敫渭毎?，并能夠長期有效表達。因此，對應(yīng)用于肝臟基因治療的載體系統(tǒng)進行研究具有重大意義?；蛑委熭d體系統(tǒng)的選擇，既要考慮基因傳遞的效率和特異性，治療基因的表達時相，也需要考慮載體進入宿主后所引起的免疫

3、反應(yīng)以及載體所引起的副作用反應(yīng)。理想化的肝臟基因治療載體需要能夠特異性的傳遞治療基因到肝臟局部，能夠?qū)崿F(xiàn)在靜息態(tài)的肝細胞中長期穩(wěn)定表達治療基因。載體本身必須無毒性和免疫原性，對載體的操作要簡便易行，便于臨床治療的應(yīng)用。目前，眾多科研人員正針對多種病毒性載體（逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒等）和非病毒載體（受體介導(dǎo)的載體、脂質(zhì)體、納米顆粒等等）進行研究和改進。
　　 本研究構(gòu)建了一種新型的肝臟靶向性基因治療載體，具有高效低毒長期有

4、效等優(yōu)點，并且能夠針對多個目標基因進行調(diào)控。以此載體為模版，通過對多個目標基因的替換，可以應(yīng)用于多種肝臟疾病的基因治療研究。該載體能夠通過非病毒載體或病毒載體導(dǎo)入到肝細胞，能夠維持至少一個月的穩(wěn)定保護作用。應(yīng)用該肝臟靶向性多功能治療載體，選擇RNA干擾CCchemokineligand-5(CCL5)和Fractalkine(FKN)和同時過表達人白介素10(humaninterleukin-10，hulL-10)，驗證了這三種基因的組

5、合操作，可以有效預(yù)防和治療高劑量腺病毒系統(tǒng)性感染或polyI∶C聯(lián)合D-GalN注射所導(dǎo)致的、NK細胞介導(dǎo)的急性肝臟免疫損傷。由于各種肝臟疾?。ɡ鐞盒阅[瘤和病毒性肝炎）通常與多個基因的調(diào)控紊亂相關(guān)，該研究提供了一種單個治療載體、以肝細胞靶向性的方式同時調(diào)控多個靶基因，從而治療肝臟疾病的方式，為肝臟疾病的免疫基因治療提供一個實用有效的工具。
　　 1.肝細胞特異性多功能載體的構(gòu)建及驗證
　　 通過比較不同的增強子、啟動子

6、組合，最終優(yōu)化組合了由甲胎蛋白增強子和白蛋白啟動子組成的肝細胞特異性啟動子。基于microRNA結(jié)構(gòu)的第二代小干擾RNA(shRNAmir)的高效基因沉默，結(jié)合shRNAmir可以由肝特異性RNA聚合酶Ⅱ類啟動子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，構(gòu)建了肝臟特異性基因治療載體。內(nèi)部核糖體進入位點序列(IRES)和shRNAmir被用來構(gòu)建多功能載體，能夠針對不同基因同時進行過表達和基因沉默。我們利用不同的報告基因進行了驗證，所構(gòu)建的肝細胞特異性多功能報告基因載體

7、能在肝癌細胞系Huh7中特異性的過表達β-半乳糖苷酶編碼基因LacZ和紅色熒光蛋白DsRed2，同時針對綠色熒光蛋白EGFP和螢火蟲熒光素酶FireflyLuciferase進行干擾。
　　 2.肝臟靶向性表達hulL-10并同時干擾CCL5和FKN能夠有效抑制腺病毒引起的肝損傷
　　 我們實驗室之前的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高壓注射帶有干擾FKN小干擾RNA的腺病毒載體，能夠顯著降低由腺病毒引起的NK細胞介導(dǎo)的急性肝臟損傷。鑒于

8、單一趨化因子的干擾可能無法達到最佳效果，我們構(gòu)建了可以操作多種功能基因的肝臟靶向性載體。我們的實驗結(jié)果表明，與單獨干擾FKN相比，聯(lián)合干擾趨化因子FKN和CCL5能夠進一步抑制淋巴細胞的浸潤和炎性細胞因子的產(chǎn)生，降低肝臟中NK細胞的比例，減輕肝臟損傷;而干擾趨化因子FKN聯(lián)合在肝臟中過表達抑制性細胞因子huIL-10，亦能進一步降低淋巴細胞的浸潤及炎性細胞因子水平。肝臟損傷的減輕從病理水平上得到進一步的確認。因此我們利用肝臟靶向性多功能

9、載體構(gòu)建了能夠同時表達huIL-10以及報告基因DsRed2，并能同時對CCL5和FKN進行基因沉默的多功能載體。這種含有8個功能片段協(xié)同作用的多功能載體可以降低肝臟NK細胞的數(shù)目和活性以及血清中炎性細胞因子IFN-γ和TNF-α的水平，從而顯著降低由高劑量腺病毒感染所誘導(dǎo)的急性肝損傷。從血清轉(zhuǎn)氨酶水平和病理結(jié)果上證明急性肝損傷被顯著抑制。
　　 該肝臟靶向性多功能載體在高壓注射到小鼠肝臟一個月之后，仍然能夠高效抑制高劑量腺病毒

10、系統(tǒng)性感染誘導(dǎo)的急性肝損傷，其保護作用具有長期性;此外，這種肝臟靶向性多功能載體不僅可以通過質(zhì)粒高壓注射的方式導(dǎo)入肝臟，也可以借助于嗜肝性感染的腺病毒載體導(dǎo)入。當這種肝臟靶向性的多功能載體包裝成腺病毒載體，并且與普通復(fù)制缺陷型腺病毒混合以高劑量系統(tǒng)性進行感染小鼠時，能夠顯著抑制腺病毒誘導(dǎo)的急性肝損傷，肝臟淋巴細胞浸潤減少，炎性細胞因子水平降低。
　　 3.肝臟靶向性多功能載體抑制PolyI∶C/D-GalN注射誘導(dǎo)的急性肝損傷<

11、br>　　 D-GalN作為肝臟致敏劑廣泛用于多種動物模型，PolyI∶C可以模擬病毒RNA引起機體免疫應(yīng)答。實驗室之前的研究結(jié)果證明PolyI∶C和D-GaIN聯(lián)合注射會誘發(fā)嚴重的急性肝損傷，這種損傷主要通過Kupffer細胞和NK細胞介導(dǎo)。因此，我們將所構(gòu)建的能夠肝臟靶向性表達huIL-10并同時干擾CCL5和FKN的多功能載體預(yù)先注射小鼠，發(fā)現(xiàn)能夠顯著抑制肝臟淋巴細胞的浸潤，降低肝臟NK細胞的比例，血清中炎性細胞因子IFN-γ和