靶向HBx的雙功能shRNA表達(dá)載體糾正肝臟內(nèi)源性和系統(tǒng)性免疫耐受及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　 全球大約有4億HBV病毒攜帶者，HBV感染可以導(dǎo)致肝硬化、肝纖維化甚至肝癌。盡管在HBV急性感染過(guò)程中，機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫可以活化并清除病毒，但是在HBV慢性感染中，HBV的持續(xù)存在抑制了機(jī)體的天然免疫和獲得性免疫，誘導(dǎo)機(jī)體的肝細(xì)胞內(nèi)源性免疫耐受和系統(tǒng)性免疫耐受，甚至導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞耗竭。
　　 CD8+T細(xì)胞，尤其是肝臟HBV特異性CD8+T細(xì)胞，在清除HBV病毒中發(fā)揮了重要作用。CD8+T

2、細(xì)胞可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α來(lái)抑制HBV的復(fù)制轉(zhuǎn)錄。但是在CHB病人中，CD8+T細(xì)胞的增殖能力和抗病毒能力均受到明顯抑制，其分泌細(xì)胞因子的能力較低，同時(shí)又高表達(dá)共抑制分子（例如PD-1，Tim-3，CTLA-4），導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞呈明顯低能、缺如乃至耗竭狀態(tài)。
　　 共抑制分子受體PD-1，不僅可以通過(guò)募集SHP2直接抑制TCR信號(hào)通路，還可以向CD8+T細(xì)胞傳遞死亡信號(hào)，促進(jìn)其凋亡。而其重要的配體PD-L

3、1，廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞表面，通過(guò)與PD-1相互作用向CD8+T細(xì)胞傳遞抑制信號(hào)。研究表明，在CHB病人中，PD-L1的水平明顯高于健康人，這說(shuō)明PD-L1參與了HBV誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受的進(jìn)程。但是HBV上調(diào)肝細(xì)胞表面PD-L1的機(jī)制還不清楚。
　　 HBV誘導(dǎo)的免疫耐受為HBV的治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，因此逆轉(zhuǎn)HBV誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)源性免疫耐受，重建系統(tǒng)性免疫系統(tǒng)，對(duì)更好的治療HBV感染具有重要意義。而實(shí)現(xiàn)這一目的的一個(gè)可行策略不再僅僅局

4、限于對(duì)病毒生命周期的直接阻斷，而是在抑制肝細(xì)胞HBV復(fù)制的同時(shí)，激活機(jī)體的免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，5'-triphosphate-siRNAs(3p-siRNAs)不僅可以靶向沉默特定基因（如病毒轉(zhuǎn)錄本或者癌基因），又可以通過(guò)RIG-Ⅰ通路激活免疫反應(yīng)，產(chǎn)生雙重的抗病毒或者抗腫瘤效果，也同樣能夠在肝細(xì)胞內(nèi)逆轉(zhuǎn)HBV誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)源性免疫耐受，相比單純的RNAi方案具有更加明顯的療效。
　　 在本研究中，我們分別在細(xì)胞系、

5、臨床肝癌標(biāo)本和通過(guò)尾靜脈高壓注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒建立的HBV持續(xù)性感染模型體內(nèi)觀察到HBV感染可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)源性免疫耐受，而這種內(nèi)源性免疫耐受可以進(jìn)一步誘導(dǎo)全身系統(tǒng)性的免疫耐受，包括HBV特異性CD8+T細(xì)胞活化、功能和應(yīng)答能力的降低及B細(xì)胞產(chǎn)生抗HBs抗體應(yīng)答能力的低下。繼而，我們構(gòu)建了一種能夠同時(shí)表達(dá)靶向沉默HBx基因的shRNA和激活免疫反應(yīng)的ssRNA的雙表達(dá)載體。我們發(fā)現(xiàn)該雙表達(dá)載體可以逆轉(zhuǎn)HBV誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)源性

6、免疫，并恢復(fù)機(jī)體的系統(tǒng)性免疫應(yīng)答能力，進(jìn)而發(fā)揮很好的抑制和清除HBV的效應(yīng)。在抑制和清除HBV的過(guò)程中，CD8+T細(xì)胞發(fā)揮了關(guān)鍵作用，且依賴于TLR7通路和Ⅰ型干擾素信號(hào)通路。
　　 另一方面，鑒于PD-1/PD-L1信號(hào)通路在HBV誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞耗竭中發(fā)揮重要作用，我們通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)了潛在靶向PD-L1的多種miRNAs，通過(guò)將化學(xué)合成的模擬物或抑制物轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)miR-200c可以下調(diào)PD-L1的表達(dá)。經(jīng)螢光

7、素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，miR-200c可以直接靶向PD-L1mRNA的3'-UTR。更為重要的是，在HBV陽(yáng)性小鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-200c，不僅可以促進(jìn)耗竭性CD8+T細(xì)胞功能的恢復(fù)，還可以抑制HBV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。
　　 方法:
　　 一方面，我們利用定量PCR比較了HepG2.2.15和HepG2、HBV+HCC和HBV-HCC、HBV+和HBV-小鼠原代肝細(xì)胞中Ⅰ型干擾素及其誘導(dǎo)基因的表達(dá)水平;并用Westernb

8、lot進(jìn)一步證實(shí)。接著，我們利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HBV陽(yáng)性小鼠淋巴細(xì)胞的分群和活化，利用ELISA檢測(cè)HBV陽(yáng)性小鼠血清中的細(xì)胞因子水平。為了更好的治療HBV感染，我們構(gòu)建了一種能夠同時(shí)表達(dá)靶向沉默HBx基因的shRNA和激活免疫反應(yīng)的ssRNA的雙表達(dá)載體(dual)，并確認(rèn)了其對(duì)HBV的直接沉默能力和激活天然免疫信號(hào)傳導(dǎo)的能力。經(jīng)過(guò)雙表達(dá)載體治療后，我們檢測(cè)了小鼠肝細(xì)胞和血清中細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌水平以及CD8+T細(xì)胞的活化水平和分泌

9、IFN-γ的能力。同時(shí)，我們利用熒光定量PCR和ELISA技術(shù)檢測(cè)了雙表達(dá)載體治療對(duì)小鼠血清中HBVDNA和HBsAg水平的影響。為了研究CD8+T細(xì)胞在雙表達(dá)載體抑制HBV復(fù)制過(guò)程中的作用，我們分別利用清除性抗體清除小鼠體內(nèi)的CD8+T細(xì)胞及將CD8+T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)輸?shù)饺笔細(xì)胞的Rag-1-/-HBV陽(yáng)性小鼠體內(nèi)，并觀察雙表達(dá)載體對(duì)HBVDNA和HBsAg的影響。最后，通過(guò)中和Ⅰ型干擾素受體和抑制TLR7信號(hào)通路，觀察其對(duì)雙表達(dá)載體活

10、化CD8+T細(xì)胞和抑制HBV復(fù)制的影響。
　　 另一方面，我們利用流式細(xì)胞術(shù)比較了HepG2.2.15和HepG2、HBV+和HBV-小鼠原代肝細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)水平。隨后，在HBV陽(yáng)性小鼠體內(nèi)，分別通過(guò)阻斷PD-L1信號(hào)通路和過(guò)表達(dá)PD-L1，觀察其對(duì)CD8+T細(xì)胞活化水平和分泌細(xì)胞因子能力的影響。為了研究是否有miRNAs參與了HBV上調(diào)PD-L1的進(jìn)程，我們利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)了潛在靶向PD-L1mRNA的3'-UTR

11、的多個(gè)miRNAs，并化學(xué)合成其模擬物和抑制物，通過(guò)體外轉(zhuǎn)染的方式觀察不同miRNAs對(duì)肝細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)的影響，初步證實(shí)miR-200c能夠調(diào)控PD-L1的表達(dá)。并通過(guò)螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)，miR-200c可以直接靶向PD-L1mRNA的3'-UTR。最后，在HBV陽(yáng)性小鼠體內(nèi)過(guò)表達(dá)miR-200c，觀察miR-200c過(guò)表達(dá)對(duì)CD8+T細(xì)胞功能及對(duì)HBV復(fù)制的影響。
　　 結(jié)果:
　　 一、靶向HBx

12、的雙功能shRNA表達(dá)載體糾正肝臟內(nèi)源性和系統(tǒng)性免疫耐受及其機(jī)制研究
　　 1、HBV誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞內(nèi)源性和系統(tǒng)性免疫耐受
　　 利用定量PCR技術(shù)比較HepG2.2.15和HepG2、HBV+HCC和HBV-HCC、HBV+和HBV-小鼠原代肝細(xì)胞中基因表達(dá)的差異，我們發(fā)現(xiàn)HBV的持續(xù)存在可以抑制Ⅰ型干擾素及其誘導(dǎo)基因的表達(dá)，而促進(jìn)免疫抑制分子TGF-β和IL-10的表達(dá)。同時(shí)，Westernblot實(shí)驗(yàn)和ELISA實(shí)驗(yàn)

13、進(jìn)一步證實(shí)了這一現(xiàn)象。這些數(shù)據(jù)表明，HBV感染可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)源性免疫耐受。
　　 同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，HBV陽(yáng)性小鼠體內(nèi)的肝臟CD8+T細(xì)胞的數(shù)量和比例明顯偏低，并且其表面PD-1的表達(dá)水平明顯升高，是正常小鼠的3倍。HBV特異性CD8+T細(xì)胞和IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的比例也明顯低于正常小鼠。更重要的是，利用HBV疫苗對(duì)HBV陽(yáng)性小鼠進(jìn)行免疫后，并不能誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的HBV特異性抗體。這些結(jié)果表明，HBV不僅可以誘

14、導(dǎo)肝細(xì)胞內(nèi)源性免疫耐受，還可以誘導(dǎo)機(jī)體系統(tǒng)性免疫耐受。
　　 2、免疫刺激性的靶向HBx的雙功能載體逆轉(zhuǎn)HBV誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞內(nèi)源性免疫耐受
　　 我們構(gòu)建了一種能夠同時(shí)表達(dá)靶向沉默HBx基因的shRNA和激活免疫反應(yīng)的ssRNA的雙表達(dá)載體(dual)。我們發(fā)現(xiàn)該雙表達(dá)載體可以明顯地誘導(dǎo)HepG2.2.15、HBV+HCC和HBV+小鼠原代肝細(xì)胞中Ⅰ型干擾素及其下游誘導(dǎo)基因的表達(dá)水平，同時(shí)抑制免疫負(fù)調(diào)分子TGF-β和IL

15、-10的表達(dá)。同時(shí)，其在體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中都具有很好的抑制HBV復(fù)制轉(zhuǎn)錄的能力。這些數(shù)據(jù)表明，dual可以很好的抑制HBV復(fù)制并成功逆轉(zhuǎn)HBV誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)源性免疫耐受。
　　 3、逆轉(zhuǎn)肝臟內(nèi)源性免疫耐受可以打破HBV誘導(dǎo)的系統(tǒng)性免疫抑制
　　 HBV陽(yáng)性小鼠注射雙表達(dá)載體后，經(jīng)過(guò)三次HBV疫苗免疫，其體內(nèi)可產(chǎn)生大量特異性抗HBs抗體。同時(shí)，雙表達(dá)載體治療也可以上調(diào)肝臟CD8+T細(xì)胞的數(shù)量和活化水平，尤其是可顯著增加HBV

16、特異性CD8+T細(xì)胞的數(shù)量并增強(qiáng)其分泌細(xì)胞因子的能力。這表明該雙表達(dá)載體可逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞內(nèi)源性免疫耐受，并進(jìn)一步促進(jìn)機(jī)體系統(tǒng)性免疫耐受的糾正，尤其是CD8+T細(xì)胞功能的恢復(fù)，最終增強(qiáng)機(jī)體抑制HBV復(fù)制的能力。
　　 進(jìn)一步，我們利用抗體分別清除了小鼠體內(nèi)的NK、CD4+T、CD8+T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)清除CD8+T細(xì)胞后，雙表達(dá)載體對(duì)HBV的抑制效果受到嚴(yán)重削弱。同時(shí)，將CD8+T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)輸?shù)絉ag-1-/-HBV陽(yáng)性小鼠，雙表達(dá)載體對(duì)受

17、體鼠體內(nèi)HBV的抑制作用顯著增強(qiáng)。這些證據(jù)表明，CD8+T細(xì)胞在雙表達(dá)載體抑制HBV復(fù)制中起關(guān)鍵作用。
　　 4、TLR7—IFN-Ⅰ在逆轉(zhuǎn)系統(tǒng)性免疫耐受中具有重要作用
　　 我們利用中和抗體中和Ⅰ型干擾素受體，或者利用抑制劑抑制TLR7信號(hào)通路之后，進(jìn)一步檢測(cè)CD8+T細(xì)胞的活化水平和HBV復(fù)制情況。發(fā)現(xiàn)不管是中和Ⅰ型干擾素受體，還是抑制TLR7信號(hào)通路，都能明顯降低CD8+T細(xì)胞的活化水平，并導(dǎo)致雙表達(dá)載體介導(dǎo)的HB

18、V復(fù)制抑制能力受損。這些結(jié)果表明，在雙表達(dá)載體逆轉(zhuǎn)HBV誘導(dǎo)免疫耐受并抑制HBV復(fù)制轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，TLR7和Ⅰ型干擾素信號(hào)通路均發(fā)揮了重要的作用。
　　 二、HBV通過(guò)下調(diào)肝細(xì)胞miR-200c表達(dá)誘導(dǎo)T細(xì)胞耗竭
　　 1、HBV通過(guò)上調(diào)肝細(xì)胞表面PD-L1水平誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞耗竭
　　 首先，我們利用流式細(xì)胞術(shù)比較了HepG2、HepG2.2.15以及轉(zhuǎn)染pAAV/HBV1.2質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞表面PD-L1

19、的水平。結(jié)果顯示，HBV可以上調(diào)肝細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)水平。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)HBV陽(yáng)性小鼠肝細(xì)胞表面的PD-L1的水平也高于正常小鼠。這些證據(jù)都表明，HBV感染后，肝細(xì)胞表面的PD-L1水平顯著上調(diào)。
　　 為了進(jìn)一步研究高水平的PD-L1在HBV誘導(dǎo)的免疫耐受中的作用，我們利用α-PD-L1阻斷HBV陽(yáng)性小鼠體內(nèi)PD-L1/PD-1信號(hào)通路，進(jìn)一步檢測(cè)CD69+CD8+、IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阻斷PD-

20、L1/PD-1信號(hào)通路可促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的活化水平及其分泌細(xì)胞因子的能力。同時(shí)，過(guò)表達(dá)PD-L1可以降低CD8+T細(xì)胞的活化水平和分泌細(xì)胞因子能力。這些結(jié)果表明，高水平的PD-L1可以抑制CD8+T細(xì)胞的活化及其細(xì)胞因子分泌。
　　 2、miR-200c直接靶向PD-L1的3'-UTR
　　 利用生物信息學(xué)手段，我們預(yù)測(cè)了靶向PD-L1mRNA3'-UTR的多個(gè)miRNAs（包括miR-200a，miR-200c和mi

21、R-383等），并化學(xué)合成這些miRNAs的模擬物和抑制物。通過(guò)體外轉(zhuǎn)染的方式初步證實(shí)miR-200c能夠調(diào)控PD-L1的表達(dá)。螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證明，miR-200c可以直接靶向PD-L1mRNA的3'-UTR，進(jìn)而濃度依賴性地下調(diào)PD-L1的水平。
　　 3、HBV可以通過(guò)下調(diào)miR-200c水平而增強(qiáng)PD-L1的表達(dá)
　　 通過(guò)比較HepG2、HepG2.2.15、轉(zhuǎn)染pAAV/HBV1.2以及HBV元件的

22、質(zhì)粒的HepG2中miR-200c的表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)HBV及HBs和HBx都可以顯著下調(diào)miR-200c的表達(dá)水平。在HBV陽(yáng)性小鼠肝細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-200c，可以逆轉(zhuǎn)HBV上調(diào)PD-L1過(guò)程。這些結(jié)果表明，HBV感染可通過(guò)抑制肝細(xì)胞內(nèi)miR-200c的表達(dá)水平，進(jìn)而增強(qiáng)肝細(xì)胞表面PD-L1的表達(dá)。
　　 4、過(guò)表達(dá)miR-200c可以逆轉(zhuǎn)HBV誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞耗竭
　　 在HBV陽(yáng)性小鼠中，miR-200c過(guò)表

23、達(dá)可以明顯增加CD69+CD8+和IFN-γ+CD8+T細(xì)胞的比例，同時(shí)抑制CD8+T細(xì)胞的凋亡。此外，miR-200c過(guò)表達(dá)也可以增加HBV特異性CD8+T細(xì)胞和記憶性CD8+T細(xì)胞的比例。這些結(jié)果表明，miR-200c過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的功能。
　　 5、過(guò)表達(dá)miR-200c可以抑制HBV陽(yáng)性小鼠的HBV復(fù)制
　　 最后，我們發(fā)現(xiàn)miR-200c過(guò)表達(dá)可以明顯降低HBV陽(yáng)性小鼠血清中的HBVDNA和HBsA

24、g，還可顯著抑制肝臟組織中HBsAg、HBcAg的表達(dá)。這些結(jié)果表明，miR-200c可以增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞的功能，進(jìn)而降低HBV載量。
　　 結(jié)論及意義:
　　 1、HBV可以誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)源性免疫耐受和系統(tǒng)性免疫耐受，進(jìn)而促進(jìn)HBV的存續(xù)。
　　 2、我們構(gòu)建的雙功能載體可以通過(guò)逆轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)源性免疫耐受恢復(fù)機(jī)體的系統(tǒng)性免疫反應(yīng)，并且具有很好的抑制HBV能力。在此過(guò)程中，CD8+T細(xì)胞具有重要作用，并且其功能的發(fā)

25、揮依賴于TLR7和Ⅰ型干擾素信號(hào)通路。
　　 3、本研究首次成功構(gòu)建基于TLR7信號(hào)通路活化的兼具免疫刺激作用和靶向沉默作用的雙功能shRNA表達(dá)載體，它不僅能有效地抑制HBV持續(xù)感染，還能逆轉(zhuǎn)HBV誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)源性和系統(tǒng)性免疫耐受。由此首次提出并驗(yàn)證“糾正肝臟內(nèi)源性免疫耐受可以逆轉(zhuǎn)全身系統(tǒng)性免疫耐受”這一觀點(diǎn)。該雙功能載體的治療策略不僅可以應(yīng)用于HBV感染治療，還可以應(yīng)用于其他病毒感染和腫瘤的治療。
　　 4、首次發(fā)