靶向HBx的雙功能shRNA表達載體糾正肝臟內(nèi)源性和系統(tǒng)性免疫耐受及其機制研究.pdf

1、研究目的:
　　 全球大約有4億HBV病毒攜帶者，HBV感染可以導致肝硬化、肝纖維化甚至肝癌。盡管在HBV急性感染過程中，機體的天然免疫和獲得性免疫可以活化并清除病毒，但是在HBV慢性感染中，HBV的持續(xù)存在抑制了機體的天然免疫和獲得性免疫，誘導機體的肝細胞內(nèi)源性免疫耐受和系統(tǒng)性免疫耐受，甚至導致CD8+T細胞耗竭。
　　 CD8+T細胞，尤其是肝臟HBV特異性CD8+T細胞，在清除HBV病毒中發(fā)揮了重要作用。CD8+T

2、細胞可以通過分泌細胞因子IFN-γ和TNF-α來抑制HBV的復制轉(zhuǎn)錄。但是在CHB病人中，CD8+T細胞的增殖能力和抗病毒能力均受到明顯抑制，其分泌細胞因子的能力較低，同時又高表達共抑制分子（例如PD-1，Tim-3，CTLA-4），導致CD8+T細胞呈明顯低能、缺如乃至耗竭狀態(tài)。
　　 共抑制分子受體PD-1，不僅可以通過募集SHP2直接抑制TCR信號通路，還可以向CD8+T細胞傳遞死亡信號，促進其凋亡。而其重要的配體PD-L

3、1，廣泛表達于多種細胞表面，通過與PD-1相互作用向CD8+T細胞傳遞抑制信號。研究表明，在CHB病人中，PD-L1的水平明顯高于健康人，這說明PD-L1參與了HBV誘導機體免疫耐受的進程。但是HBV上調(diào)肝細胞表面PD-L1的機制還不清楚。
　　 HBV誘導的免疫耐受為HBV的治療帶來巨大挑戰(zhàn)，因此逆轉(zhuǎn)HBV誘導的肝細胞內(nèi)源性免疫耐受，重建系統(tǒng)性免疫系統(tǒng)，對更好的治療HBV感染具有重要意義。而實現(xiàn)這一目的的一個可行策略不再僅僅局

4、限于對病毒生命周期的直接阻斷，而是在抑制肝細胞HBV復制的同時，激活機體的免疫反應。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，5'-triphosphate-siRNAs(3p-siRNAs)不僅可以靶向沉默特定基因（如病毒轉(zhuǎn)錄本或者癌基因），又可以通過RIG-Ⅰ通路激活免疫反應，產(chǎn)生雙重的抗病毒或者抗腫瘤效果，也同樣能夠在肝細胞內(nèi)逆轉(zhuǎn)HBV誘導的肝細胞內(nèi)源性免疫耐受，相比單純的RNAi方案具有更加明顯的療效。
　　 在本研究中，我們分別在細胞系、

5、臨床肝癌標本和通過尾靜脈高壓注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒建立的HBV持續(xù)性感染模型體內(nèi)觀察到HBV感染可以誘導肝細胞內(nèi)源性免疫耐受，而這種內(nèi)源性免疫耐受可以進一步誘導全身系統(tǒng)性的免疫耐受，包括HBV特異性CD8+T細胞活化、功能和應答能力的降低及B細胞產(chǎn)生抗HBs抗體應答能力的低下。繼而，我們構建了一種能夠同時表達靶向沉默HBx基因的shRNA和激活免疫反應的ssRNA的雙表達載體。我們發(fā)現(xiàn)該雙表達載體可以逆轉(zhuǎn)HBV誘導的肝細胞內(nèi)源性

6、免疫，并恢復機體的系統(tǒng)性免疫應答能力，進而發(fā)揮很好的抑制和清除HBV的效應。在抑制和清除HBV的過程中，CD8+T細胞發(fā)揮了關鍵作用，且依賴于TLR7通路和Ⅰ型干擾素信號通路。
　　 另一方面，鑒于PD-1/PD-L1信號通路在HBV誘導的CD8+T細胞耗竭中發(fā)揮重要作用，我們通過生物信息學預測了潛在靶向PD-L1的多種miRNAs，通過將化學合成的模擬物或抑制物轉(zhuǎn)染到細胞中，發(fā)現(xiàn)miR-200c可以下調(diào)PD-L1的表達。經(jīng)螢光

7、素酶報告基因?qū)嶒炞C實，miR-200c可以直接靶向PD-L1mRNA的3'-UTR。更為重要的是，在HBV陽性小鼠體內(nèi)過表達miR-200c，不僅可以促進耗竭性CD8+T細胞功能的恢復，還可以抑制HBV的復制和轉(zhuǎn)錄。
　　 方法:
　　 一方面，我們利用定量PCR比較了HepG2.2.15和HepG2、HBV+HCC和HBV-HCC、HBV+和HBV-小鼠原代肝細胞中Ⅰ型干擾素及其誘導基因的表達水平;并用Westernb

8、lot進一步證實。接著，我們利用流式細胞術檢測HBV陽性小鼠淋巴細胞的分群和活化，利用ELISA檢測HBV陽性小鼠血清中的細胞因子水平。為了更好的治療HBV感染，我們構建了一種能夠同時表達靶向沉默HBx基因的shRNA和激活免疫反應的ssRNA的雙表達載體(dual)，并確認了其對HBV的直接沉默能力和激活天然免疫信號傳導的能力。經(jīng)過雙表達載體治療后，我們檢測了小鼠肝細胞和血清中細胞因子的表達和分泌水平以及CD8+T細胞的活化水平和分泌

9、IFN-γ的能力。同時，我們利用熒光定量PCR和ELISA技術檢測了雙表達載體治療對小鼠血清中HBVDNA和HBsAg水平的影響。為了研究CD8+T細胞在雙表達載體抑制HBV復制過程中的作用，我們分別利用清除性抗體清除小鼠體內(nèi)的CD8+T細胞及將CD8+T細胞過繼轉(zhuǎn)輸?shù)饺笔細胞的Rag-1-/-HBV陽性小鼠體內(nèi)，并觀察雙表達載體對HBVDNA和HBsAg的影響。最后，通過中和Ⅰ型干擾素受體和抑制TLR7信號通路，觀察其對雙表達載體活

10、化CD8+T細胞和抑制HBV復制的影響。
　　 另一方面，我們利用流式細胞術比較了HepG2.2.15和HepG2、HBV+和HBV-小鼠原代肝細胞表面PD-L1的表達水平。隨后，在HBV陽性小鼠體內(nèi)，分別通過阻斷PD-L1信號通路和過表達PD-L1，觀察其對CD8+T細胞活化水平和分泌細胞因子能力的影響。為了研究是否有miRNAs參與了HBV上調(diào)PD-L1的進程，我們利用生物信息學預測了潛在靶向PD-L1mRNA的3'-UTR

11、的多個miRNAs，并化學合成其模擬物和抑制物，通過體外轉(zhuǎn)染的方式觀察不同miRNAs對肝細胞表面PD-L1表達的影響，初步證實miR-200c能夠調(diào)控PD-L1的表達。并通過螢光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步證實，miR-200c可以直接靶向PD-L1mRNA的3'-UTR。最后，在HBV陽性小鼠體內(nèi)過表達miR-200c，觀察miR-200c過表達對CD8+T細胞功能及對HBV復制的影響。
　　 結果:
　　 一、靶向HBx

12、的雙功能shRNA表達載體糾正肝臟內(nèi)源性和系統(tǒng)性免疫耐受及其機制研究
　　 1、HBV誘導肝臟細胞內(nèi)源性和系統(tǒng)性免疫耐受
　　 利用定量PCR技術比較HepG2.2.15和HepG2、HBV+HCC和HBV-HCC、HBV+和HBV-小鼠原代肝細胞中基因表達的差異，我們發(fā)現(xiàn)HBV的持續(xù)存在可以抑制Ⅰ型干擾素及其誘導基因的表達，而促進免疫抑制分子TGF-β和IL-10的表達。同時，Westernblot實驗和ELISA實驗

13、進一步證實了這一現(xiàn)象。這些數(shù)據(jù)表明，HBV感染可以誘導肝細胞內(nèi)源性免疫耐受。
　　 同時，我們發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，HBV陽性小鼠體內(nèi)的肝臟CD8+T細胞的數(shù)量和比例明顯偏低，并且其表面PD-1的表達水平明顯升高，是正常小鼠的3倍。HBV特異性CD8+T細胞和IFN-γ+CD8+T細胞的比例也明顯低于正常小鼠。更重要的是，利用HBV疫苗對HBV陽性小鼠進行免疫后，并不能誘導產(chǎn)生大量的HBV特異性抗體。這些結果表明，HBV不僅可以誘

14、導肝細胞內(nèi)源性免疫耐受，還可以誘導機體系統(tǒng)性免疫耐受。
　　 2、免疫刺激性的靶向HBx的雙功能載體逆轉(zhuǎn)HBV誘導的肝臟細胞內(nèi)源性免疫耐受
　　 我們構建了一種能夠同時表達靶向沉默HBx基因的shRNA和激活免疫反應的ssRNA的雙表達載體(dual)。我們發(fā)現(xiàn)該雙表達載體可以明顯地誘導HepG2.2.15、HBV+HCC和HBV+小鼠原代肝細胞中Ⅰ型干擾素及其下游誘導基因的表達水平，同時抑制免疫負調(diào)分子TGF-β和IL

15、-10的表達。同時，其在體外、體內(nèi)實驗中都具有很好的抑制HBV復制轉(zhuǎn)錄的能力。這些數(shù)據(jù)表明，dual可以很好的抑制HBV復制并成功逆轉(zhuǎn)HBV誘導的肝細胞內(nèi)源性免疫耐受。
　　 3、逆轉(zhuǎn)肝臟內(nèi)源性免疫耐受可以打破HBV誘導的系統(tǒng)性免疫抑制
　　 HBV陽性小鼠注射雙表達載體后，經(jīng)過三次HBV疫苗免疫，其體內(nèi)可產(chǎn)生大量特異性抗HBs抗體。同時，雙表達載體治療也可以上調(diào)肝臟CD8+T細胞的數(shù)量和活化水平，尤其是可顯著增加HBV

16、特異性CD8+T細胞的數(shù)量并增強其分泌細胞因子的能力。這表明該雙表達載體可逆轉(zhuǎn)肝細胞內(nèi)源性免疫耐受，并進一步促進機體系統(tǒng)性免疫耐受的糾正，尤其是CD8+T細胞功能的恢復，最終增強機體抑制HBV復制的能力。
　　 進一步，我們利用抗體分別清除了小鼠體內(nèi)的NK、CD4+T、CD8+T細胞，發(fā)現(xiàn)清除CD8+T細胞后，雙表達載體對HBV的抑制效果受到嚴重削弱。同時，將CD8+T細胞過繼轉(zhuǎn)輸?shù)絉ag-1-/-HBV陽性小鼠，雙表達載體對受

17、體鼠體內(nèi)HBV的抑制作用顯著增強。這些證據(jù)表明，CD8+T細胞在雙表達載體抑制HBV復制中起關鍵作用。
　　 4、TLR7—IFN-Ⅰ在逆轉(zhuǎn)系統(tǒng)性免疫耐受中具有重要作用
　　 我們利用中和抗體中和Ⅰ型干擾素受體，或者利用抑制劑抑制TLR7信號通路之后，進一步檢測CD8+T細胞的活化水平和HBV復制情況。發(fā)現(xiàn)不管是中和Ⅰ型干擾素受體，還是抑制TLR7信號通路，都能明顯降低CD8+T細胞的活化水平，并導致雙表達載體介導的HB

18、V復制抑制能力受損。這些結果表明，在雙表達載體逆轉(zhuǎn)HBV誘導免疫耐受并抑制HBV復制轉(zhuǎn)錄過程中，TLR7和Ⅰ型干擾素信號通路均發(fā)揮了重要的作用。
　　 二、HBV通過下調(diào)肝細胞miR-200c表達誘導T細胞耗竭
　　 1、HBV通過上調(diào)肝細胞表面PD-L1水平誘導CD8+T細胞耗竭
　　 首先，我們利用流式細胞術比較了HepG2、HepG2.2.15以及轉(zhuǎn)染pAAV/HBV1.2質(zhì)粒的HepG2細胞表面PD-L1

19、的水平。結果顯示，HBV可以上調(diào)肝細胞表面PD-L1的表達水平。同時，我們發(fā)現(xiàn)HBV陽性小鼠肝細胞表面的PD-L1的水平也高于正常小鼠。這些證據(jù)都表明，HBV感染后，肝細胞表面的PD-L1水平顯著上調(diào)。
　　 為了進一步研究高水平的PD-L1在HBV誘導的免疫耐受中的作用，我們利用α-PD-L1阻斷HBV陽性小鼠體內(nèi)PD-L1/PD-1信號通路，進一步檢測CD69+CD8+、IFN-γ+CD8+T細胞的比例。結果發(fā)現(xiàn)，阻斷PD-

20、L1/PD-1信號通路可促進CD8+T細胞的活化水平及其分泌細胞因子的能力。同時，過表達PD-L1可以降低CD8+T細胞的活化水平和分泌細胞因子能力。這些結果表明，高水平的PD-L1可以抑制CD8+T細胞的活化及其細胞因子分泌。
　　 2、miR-200c直接靶向PD-L1的3'-UTR
　　 利用生物信息學手段，我們預測了靶向PD-L1mRNA3'-UTR的多個miRNAs（包括miR-200a，miR-200c和mi

21、R-383等），并化學合成這些miRNAs的模擬物和抑制物。通過體外轉(zhuǎn)染的方式初步證實miR-200c能夠調(diào)控PD-L1的表達。螢光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步證明，miR-200c可以直接靶向PD-L1mRNA的3'-UTR，進而濃度依賴性地下調(diào)PD-L1的水平。
　　 3、HBV可以通過下調(diào)miR-200c水平而增強PD-L1的表達
　　 通過比較HepG2、HepG2.2.15、轉(zhuǎn)染pAAV/HBV1.2以及HBV元件的

22、質(zhì)粒的HepG2中miR-200c的表達水平，我們發(fā)現(xiàn)HBV及HBs和HBx都可以顯著下調(diào)miR-200c的表達水平。在HBV陽性小鼠肝細胞過表達miR-200c，可以逆轉(zhuǎn)HBV上調(diào)PD-L1過程。這些結果表明，HBV感染可通過抑制肝細胞內(nèi)miR-200c的表達水平，進而增強肝細胞表面PD-L1的表達。
　　 4、過表達miR-200c可以逆轉(zhuǎn)HBV誘導的CD8+T細胞耗竭
　　 在HBV陽性小鼠中，miR-200c過表

23、達可以明顯增加CD69+CD8+和IFN-γ+CD8+T細胞的比例，同時抑制CD8+T細胞的凋亡。此外，miR-200c過表達也可以增加HBV特異性CD8+T細胞和記憶性CD8+T細胞的比例。這些結果表明，miR-200c過表達可增強CD8+T細胞的功能。
　　 5、過表達miR-200c可以抑制HBV陽性小鼠的HBV復制
　　 最后，我們發(fā)現(xiàn)miR-200c過表達可以明顯降低HBV陽性小鼠血清中的HBVDNA和HBsA

24、g，還可顯著抑制肝臟組織中HBsAg、HBcAg的表達。這些結果表明，miR-200c可以增強CD8+T細胞的功能，進而降低HBV載量。
　　 結論及意義:
　　 1、HBV可以誘導機體細胞內(nèi)源性免疫耐受和系統(tǒng)性免疫耐受，進而促進HBV的存續(xù)。
　　 2、我們構建的雙功能載體可以通過逆轉(zhuǎn)細胞內(nèi)源性免疫耐受恢復機體的系統(tǒng)性免疫反應，并且具有很好的抑制HBV能力。在此過程中，CD8+T細胞具有重要作用，并且其功能的發(fā)

25、揮依賴于TLR7和Ⅰ型干擾素信號通路。
　　 3、本研究首次成功構建基于TLR7信號通路活化的兼具免疫刺激作用和靶向沉默作用的雙功能shRNA表達載體，它不僅能有效地抑制HBV持續(xù)感染，還能逆轉(zhuǎn)HBV誘導的肝細胞內(nèi)源性和系統(tǒng)性免疫耐受。由此首次提出并驗證“糾正肝臟內(nèi)源性免疫耐受可以逆轉(zhuǎn)全身系統(tǒng)性免疫耐受”這一觀點。該雙功能載體的治療策略不僅可以應用于HBV感染治療，還可以應用于其他病毒感染和腫瘤的治療。
　　 4、首次發(fā)