靶向Pim-3的雙功能shRNA表達載體的構(gòu)建及其對小鼠肝癌的治療作用.pdf

1、目的：
　　 肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，近年來隨著分子生物學等基礎(chǔ)研究向肝癌領(lǐng)域的滲透，許多學者開始從分子水平上研究肝癌的發(fā)生與發(fā)展，其中一些原癌基因的異常高表達得到了廣泛的關(guān)注。由此把基因治療和生物治療引入到肝癌治療中，RNAi(RNAinterference)技術(shù)就是研究得比較廣泛的一種。本課題選擇針對肝癌靶基因Pim-3進行研究，是因為目前關(guān)于它的研究主要集中在造血系統(tǒng)及消化系統(tǒng)的一些腫瘤，但有關(guān)Pim-3和肝癌的關(guān)

2、系報道并不多。另一方面，在腫瘤的發(fā)生過程中，腫瘤細胞可以通過許多機制，比如增加IL-10或者TGF-β等免疫抑制性細胞因子的產(chǎn)生、促進調(diào)節(jié)性T細胞的活化以及增殖等來抑制機體免疫應(yīng)答，從而使自身逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，促進腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。因此對于腫瘤的治療，通過一些免疫刺激劑比如某些RNA序列，來激活機體某些固有的模式識別受體，有望通過激活天然免疫應(yīng)答，來重新喚醒機體的整個免疫系統(tǒng)，進而引起機體本身對于肝癌細胞的主動殺傷和清除?；谏鲜霰尘?/p>

3、，我們設(shè)計并構(gòu)建這樣一種雙功能載體:既能夠表達靶向沉默Pim-3基因的shRNA，又能夠表達激活TLR受體的單鏈RNA。在體外觀察雙功能載體對Pim-3-的沉默作用和對肝癌細胞系凋亡、增殖等細胞生物學特性的影響，及其對于免疫系統(tǒng)的活化情況;同時以Hepa1-6細胞對C57BL/6小鼠進行皮下荷瘤，在腫瘤形成后，瘤內(nèi)注射這種雙功能的表達載體，觀察其對于腫瘤的治療情況以及脾臟淋巴細胞的活化情況。
　　 方法：
　　 1.以小

4、鼠的肝癌細胞系Hepa1-6為主要研究對象，首先通過RT-PCR和Western-blot檢測Pim-3在兩種小鼠肝癌細胞系Hepa1-6和H22以及正常的小鼠胚胎肝細胞BNL.CL2中的表達。
　　 2.用雙功能載體轉(zhuǎn)染肝癌細胞系Hepa1-6，通過PCR和Western-blot等方法檢測載體對Pim-3表達的沉默效果;檢測Hepa1-6細胞中TLR信號通路的活化情況，主要檢測Ⅰ型干擾素的分泌，以確定雙功能載體是否構(gòu)建成功。

5、
　　 3.用雙功能載體轉(zhuǎn)染Hepa1-624h后，利用流式細胞儀，通過AnnexinV/PI染色和TUNEL免疫熒光技術(shù)檢測肝癌細胞凋亡的變化。
　　 4.用雙功能載體轉(zhuǎn)染Hepa1-624h后，通過Western-blot等方法檢測Bad、p-Bad、BCL-2、BCL-XL等凋亡相關(guān)分子的表達以及凋亡信號通路中caspase-8的活化水平。
　　 5.用Hepa1-6對C57BL/6小鼠進行皮下荷瘤，觀察瘤

6、內(nèi)注射雙功能載體后，小鼠腫瘤的生長情況，以及脾臟不同淋巴細胞的比例和活化情況。
　　 6.進一步研究雙功能載體治療后，脾臟中NK細胞對Hepa1-6的殺傷情況、NK細胞NK受體的表達情況、CD4+T細胞PD-1表達以及外周血TH1和TH2類細胞因子的分泌情況。
　　 7.用Hepa1-6對C57BL/6小鼠進行皮下荷瘤，通過清除抗體分別對NK和CD4+T細胞進行清除，觀察在雙功能載體介導的抗腫瘤作用中，這兩種細胞所起的作

7、用。
　　 8.體外觀察雙功能載體作用于Hepa1-6細胞后TLR7的表達情況和NF-κB信號通路的活化情況;通過TLR特異性功能抑制實驗來確定TLR7在雙功能載體介導的腫瘤治療中所發(fā)揮的作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.Pim-3在正常小鼠肝組織和正常肝細胞中表達極低，而在肝癌細胞系中明顯高表達。
　　 2.成功構(gòu)建既能沉默原癌基因Pim-3又能表達具有免疫刺激作用的ssRNA-shRNA雙功能載體。

8、r>　　 3.用雙功能載體轉(zhuǎn)染Hepa1-6細胞后，Hepa1-6細胞中的Pim-3在蛋白水平和基因水平上的表達均有明顯的下調(diào)，細胞凋亡明顯增加，凋亡相關(guān)分子p-Bad、BCL-2、BCL-xl的表達明顯下調(diào)，caspase-8的分泌明顯增加。
　　 4.用Hepa1-6細胞對C57BL/6小鼠進行皮下荷瘤2周，隨后瘤內(nèi)注射雙功能載體進行治療，發(fā)現(xiàn)雙功能載體可以顯著抑制腫瘤的生長，同時增加脾臟淋巴細胞中NK細胞和CD4+T細胞

9、的比例，并且誘導NK細胞和CD4+T細胞的活化。
　　 5.進一步分析脾臟NK細胞的殺傷活性發(fā)現(xiàn)，在用雙功能載體治療后的小鼠中，NK細胞表現(xiàn)出最強的殺傷活性，同時NK細胞NKG2D表達增強，NKG2A表達降低;IFN-γ表達增強，PD-1的表達降低，而CD4+T細胞所表達的PD-1也明顯降低，外周血中TH1細胞因子表達增加，而TH2細胞因子的表達減少。
　　 6.用Hepa1-6對C57BL/6和小鼠進行皮下荷瘤，腫瘤形

10、成后，通過特異性抗體分別對NK或者CD4+T細胞進行清除，發(fā)現(xiàn)清除NK細胞后雙功能載體的抗腫瘤作用明顯削弱。
　　 7.CD4+T細胞的存在對于維持NK細胞的活化起著重要的作用，在清除CD4+T細胞后，NK細胞的活化明顯減弱。
　　 8.在體外用雙功能載體轉(zhuǎn)染Hepa1-6細胞后，TLR7表達明顯上調(diào)，NF-κB的磷酸化水平升高;通過抑制劑阻斷小鼠體內(nèi)的TLR7后，雙功能載體的抗腫瘤活性減弱，NK和CD4+T細胞的活化都

11、受到了影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建了能夠特異性沉默Pim-3和表達免疫刺激性ssRNA的雙功能載體。
　　 2.雙功能表達載體能顯著抑制肝癌細胞中Pim-3的內(nèi)源性表達，進而明顯誘導肝癌細胞系Hepa1-6細胞的凋亡，并能誘導Ⅰ型干擾素的基因表達和蛋白分泌。
　　 3.雙功能載體能抑制肝癌皮下荷瘤小鼠中腫瘤的生長，并能引起脾臟和腫瘤原位淋巴細胞NK和CD4+T細胞的活化。
　　 4.在

12、雙功能載體介導的腫瘤治療作用中，NK細胞的功能是必不可少的。雙功能載體能增強NK細胞活化性受體NKG2D的表達，下調(diào)抑制性受體NKG2A的表達，且增強腫瘤細胞表面NKG2D配體的表達，從而提高NK細胞對腫瘤細胞的直接殺傷活性。
　　 5.雙功能載體能明顯誘導CD4+T細胞的活化，而且CD4+T細胞主要對NK細胞的活化起著輔助作用。
　　 6.在雙功能載體介導的腫瘤治療過程中，TLR7對ssRNA的識別及其信號通路的活化是