靶向NRas和c-Myc的shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、RNA干擾已經(jīng)發(fā)展成為一種非常有潛力的腫瘤基因治療手段。用于治療的RNA干擾物質(zhì)主要有化學(xué)合成siRNA和shRNA表達(dá)載體。在體內(nèi)shRNA表達(dá)載體具有更穩(wěn)定的RNA干擾作用，便于進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間的基因功能研究。shRNA表達(dá)載體法分為病毒載體法和非病毒載體法兩種。shRNA病毒表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染效率高，但安全性低。因此研究安全性較高的shRNA非病毒表達(dá)載體是很有必要的。 一、一種可同時(shí)表達(dá)多種shRNA的載體pCSH1的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

2、shRNA非病毒表達(dá)載體安全性高，但它轉(zhuǎn)染效率較低。主要原因是質(zhì)粒DNA難于從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，可通過(guò)降低質(zhì)粒的大小來(lái)改善。質(zhì)粒DNA在細(xì)胞內(nèi)可以促發(fā)干擾素效應(yīng)，引起非特異毒性，可通過(guò)降低質(zhì)粒的用量來(lái)解決。我們構(gòu)建了用于治療的shRNA非病毒表達(dá)載體pCSH1，在設(shè)計(jì)時(shí)注意了盡量提高RNA干擾的效率和盡量降低載體的非特異毒性?xún)蓚€(gè)問(wèn)題。載體采用了pUC19的質(zhì)?；拘蛄校琑NA聚合酶Ⅲ識(shí)別的H1啟動(dòng)子，以使載體盡量小。并將多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)

3、錄單位利用同尾酶的特性串聯(lián)在一個(gè)質(zhì)粒上，以使載體的用量降低。 為了驗(yàn)證pCSH1是否可以實(shí)現(xiàn)單個(gè)基因的RNA干擾，我們?cè)O(shè)計(jì)針對(duì)NRas和c-Myc的shRNA靶序列，分別構(gòu)建入pCSH1，分別命名為pCSH1-shN2和pCSH1-shMyc3。并用RT-PCR和WesternBlot檢測(cè)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的靶基因RNA水平和蛋白水平的變化。結(jié)果表明pCSH1-shN2和pCSH1-shMyc3可以特異性降低靶基因的RNA水平和蛋白

4、水平。 為了驗(yàn)證pCSH1是否可以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位的串聯(lián)，我們構(gòu)建了針對(duì)腫瘤相關(guān)基因NRas同一位點(diǎn)的shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的載體pCSH1-2shN2，以及分別針對(duì)NRas和c-Myc的shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的載體pCSH1-shNM。生長(zhǎng)曲線(xiàn)法實(shí)驗(yàn)表明相同質(zhì)量的pCSH1-2shN2對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制明顯強(qiáng)于pCSH1-shN2。WesternBlotting分析顯示pCSH1-shNM既能有效抑制NRas

5、又能有效抑制c-Myc的基因表達(dá)水平。我們還構(gòu)建了含3～6個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)的載體，結(jié)果表明pCSH1能將多個(gè)shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)在一個(gè)載體上。 我們構(gòu)建的載體pCSH1有如下特點(diǎn)：1.分子量??；2.能將shRNA轉(zhuǎn)錄單位串聯(lián)；3.串聯(lián)之后能進(jìn)行有效的干擾。 二、以NRas為靶點(diǎn)的shRNA表達(dá)載體的抗腫瘤活性研究約30％人腫瘤經(jīng)常通過(guò)點(diǎn)突變使Ras蛋白處于組成型活性狀態(tài)。NRas突變?cè)诟伟┲械某霈F(xiàn)頻率約為30％

6、，在肝癌治療中是一個(gè)理想的靶點(diǎn)。運(yùn)用RNA干擾技術(shù)可以特異地沉默突變型Ras的表達(dá)。 研究結(jié)果顯示，靶向NRas的兩個(gè)載體pCSH1-shN1和pCSH1-shN2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NRas突變的人肝癌HepG2細(xì)胞和人纖維肉瘤HT-1080細(xì)胞，以及NRas基因表達(dá)增加的人乳腺癌上皮MCF-7細(xì)胞，都能夠?qū)е翹Ras蛋白表達(dá)量降低，并且干擾作用可以達(dá)到比較高的特異性，能識(shí)別只有一個(gè)堿基差異的NRasmRNA。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)法和克隆形成法檢

7、測(cè)pCSH1-shN2對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明pCSH1-shN2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后細(xì)胞生長(zhǎng)速度降低，克隆形成率顯著降低。說(shuō)明pCSH1-shN2對(duì)細(xì)胞增殖和克隆形成都有明顯影響。 流式細(xì)胞法檢測(cè)pCSH1-shN2對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布的影響，結(jié)果表明pCSH1-shN2質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染處理后細(xì)胞發(fā)生了微弱的G1期阻滯，G1期細(xì)胞的百分比由57.4％增加到65.4％。轉(zhuǎn)染后用G2期阻滯藥nocodazole處理細(xì)胞12小

8、時(shí)后，control組、pCSH1-shMock組和pCSH1-shN2組的G1期細(xì)胞百分比分別為4.6％、6.7％和13.8％。結(jié)果說(shuō)明pCSH1-shN2能夠?qū)е虏糠諫1期阻滯。 WesternBlot結(jié)果顯示，pCSH1-shN2轉(zhuǎn)染后，HepG2細(xì)胞內(nèi)NRas、p-ERK、cyclinD1、p-RB、c-Myc的蛋白水平降低，并呈時(shí)間依賴(lài)性。結(jié)果說(shuō)明pCSH1-shN2通過(guò)特異性干擾mRNA抑制NRas的表達(dá)，導(dǎo)致信號(hào)蛋

9、白p-ERK、cyclinD1、p-RB、c-Myc水平的下降，進(jìn)一步抑制細(xì)胞的增殖。 采用人肝癌HepG2裸鼠體內(nèi)移植模型檢測(cè)載體pCSH1-shN2的體內(nèi)抗腫瘤作用。結(jié)果顯示，0.5mg/kg瘤內(nèi)給藥，隔天1次，共8次，第27天時(shí)pCSH1-shN2和pCSH1-shMock對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制率分別為52％和10％；加倍劑量，第39天時(shí)pCSH1-shN2和pCSH1-shMock對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制率分別為69％和38％；劑量加

10、倍后pCSH1-shN2和pCSH1-shMock對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制率分別提高了17％和28％，提示劑量較大時(shí)質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞的非特異毒性比較明顯，結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)一致。 把pCSH1-shN2轉(zhuǎn)染到人肝癌HepG2細(xì)胞中，獲得了NRas表達(dá)被干擾的單克隆HepG2/n9細(xì)胞，并采用SRB法檢測(cè)該細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。結(jié)果表明，HepG2/n9細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的敏感性提高了一倍，而對(duì)紫杉醇、粉防己堿和阿霉素的敏感性沒(méi)有變化或降低，表明Hep

11、G2細(xì)胞中NRas通路降低會(huì)增加細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)春新堿的敏感性。結(jié)果提示，長(zhǎng)春新堿與pCSH1-shN2聯(lián)合處理裸鼠移植瘤HepG2可能會(huì)有比較好的抑瘤率。 以上結(jié)果表明，非病毒載體pCSH1-shN2通過(guò)特異性干擾NRas的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。pCSH1-shN2在體內(nèi)也具有一定的抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。因此，以NRas為靶點(diǎn)的shRNA的非病毒載體pCSH1-shN2可能成為一種新型腫瘤基因治療藥物。 三、可同時(shí)表達(dá)兩種sh

12、RNA的載體pCSH1-shNM的抗腫瘤活性研究癌基因Ras和Myc經(jīng)常在腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或突變。本實(shí)驗(yàn)將以NRas和c-Myc為靶點(diǎn)的shRNA模板序列串聯(lián)構(gòu)建到載體pCSH1中，命名為載體pCSH1-shNM，使該載體在導(dǎo)入HepG2細(xì)胞后即可同時(shí)抑制兩個(gè)基因的表達(dá)?？寺⌒纬煞y(cè)定表明pCSH1-shNM對(duì)HepG2細(xì)胞克隆形成的抑制作用大于pCSH1-shN2和pCSH1-shMyc3。結(jié)果提示同時(shí)干擾NRas或c-Myc對(duì)細(xì)胞克

13、隆形成的抑制作用強(qiáng)于單獨(dú)干擾NRas或c-Myc。 流式細(xì)胞法結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)pCSH1-shNM質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染處理后，細(xì)胞周期分布沒(méi)有明顯變化，但凋亡細(xì)胞百分比明顯高于pCSH1-shN2和pCSH1-shMyc3單獨(dú)轉(zhuǎn)染組。結(jié)果提示同時(shí)干擾NRas或c-Myc能明顯增強(qiáng)凋亡誘導(dǎo)作用。WesternBlot分析表明，pCSH1-shNM組與pCSH1-shN2組相關(guān)蛋白水平變化一致的有NRas、CDK2、p-ERK、p-RB，pC

14、SH1-shNM組與pCSH1-shMyc3組相關(guān)蛋白水平變化一致的有c-Myc、CyclinA。與其它組不同的是pCSH1-shNM組顯著提高Raf-1的表達(dá)，說(shuō)明NRas和c-Myc在信號(hào)通路中有聯(lián)系，表達(dá)同時(shí)降低后信號(hào)通路會(huì)出現(xiàn)與任一單獨(dú)干擾不同的變化。 采用人肝癌HepG2裸鼠體內(nèi)移植模型檢測(cè)pCSH1-shNM的體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果顯示，1mg/kg瘤內(nèi)給藥，隔天1次，共給藥8次，第35天時(shí)pCSH1-shN2對(duì)腫

15、瘤生長(zhǎng)的抑制率為70％，pCSH1-shMyc3對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制率為80％，pCSH1-shNM對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制率為70％。結(jié)果表明pCSH1-shNM對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用與pCSH1-shN2接近，但比pCSH1-shMyc3低。同時(shí)抑制NRas和c-Myc的表達(dá)在裸鼠體內(nèi)移植瘤HepG2中并未表現(xiàn)出協(xié)同作用。 綜上所述，腫瘤細(xì)胞中存在的異常表達(dá)的癌基因可以通過(guò)RNA干擾的手段同時(shí)抑制，并能比單基因抑制更有效地逆轉(zhuǎn)某些惡性表型