腫瘤細胞線粒體靶向遞藥系統(tǒng)的構(gòu)建及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、阿霉素（doxorubicin，DOX）是臨床常用的廣譜抗腫瘤藥物之一，療效確切、價格低廉。但是由于其心臟毒性及高的耐藥率嚴重限制它的臨床應用。研究發(fā)現(xiàn)DOX除了作用于細胞核DNA外，線粒體也是其重要靶點。如果將DOX特異地遞送到腫瘤細胞的細胞核及線粒體，便可以提高其療效、降低全身毒副作用。很多人類腫瘤細胞如黑色素瘤、非小細胞肺癌、乳腺癌和前列腺癌等高表達 Sigma受體，茴香酰胺（AA）是Sigma受體的選擇性配體。經(jīng)AA修飾的遞藥系

2、統(tǒng)具有腫瘤主動靶向功能。
　　目的：
　　本研究以 AA為腫瘤細胞特異性靶向配基，分別構(gòu)建基于二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）的酸敏膠束遞藥系統(tǒng)和基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）的酸敏納米粒遞藥系統(tǒng)，將DOX遞送至腫瘤細胞線粒體，以期提高DOX的抗腫瘤活性、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥、降低DOX的全身毒副功能。
　　方法：
　　以 DSPE、聚乙二醇（PEG）、對乙?；郊姿?、對甲氧基苯甲酰氯、膽固醇（CHOL）、三苯基

3、溴化膦（triphenylphosphonium，TPP）、地喹氯銨（dequalinium，DQA）和DOX為原料，合成DOX線粒體靶向連接物DQA-DOX，以及AA-PEG-hyd-DSPE、AA-PEG-hyd-CHOL、TPP-CHOL等連接物，并通過質(zhì)譜、紅外與核磁對合成的連接物進行結(jié)構(gòu)鑒定。采用乳化溶劑揮發(fā)法制備同時包封DOX和DQA-DOX的酸敏膠束DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA、只包封 DOX的酸

4、敏膠束 DOX@DSPE-hyd-PEG-AA，以及AA-PEG-hyd-CHOL與TPP-CHOL修飾的包封DOX的PLGA納米粒LNPs，并對遞藥系統(tǒng)進行表征。采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT）觀察 DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA、DOX@DSPE-hyd-PEG-AA以及 LNPs的體外抗腫瘤活性。采用試劑盒法觀察 DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA、DOX@DSPE-hyd-

5、PEG-AA以及LNPs誘導腫瘤細胞凋亡的作用。采用激光共聚焦顯微鏡觀察腫瘤細胞對 DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA和LNPs的攝取，以及DOX在腫瘤細胞內(nèi)的分布情況。構(gòu)建裸鼠荷瘤（MDA-MB-231/ADR細胞、A549細胞）模型，分別觀察DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA以及LNPs的體內(nèi)抗腫瘤活性，采用活體成像儀觀察荷瘤裸鼠靜脈注射給予 DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-

6、AA以及LNPs后，DOX在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)質(zhì)譜、紅外、1H NMR鑒定結(jié)果表明所合成的連接物均為目標產(chǎn)物。
　　2. DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA的粒徑為224 nm，DOX和DQA-DOX的載藥量分別為6.2％和6.5%。DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA的體外釋藥具有pH依賴性：在pH5.0的緩沖液中，96 h內(nèi)DOX和DQA-DOX的累積

7、釋放百分率分別為90%和80%。體外抗腫瘤活性結(jié)果表明，DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA可以濃度依賴性地抑制腫瘤細胞生長。在DOX濃度為50μmol/L，DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA處理A549細胞與MDA-MB-231/ADR細胞48 h后，細胞存活率分別為24%和34%。激光共聚焦顯微鏡觀察表明，DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA進入細胞后，DOX首先分布于腫瘤細胞

8、溶酶體，最終進入到線粒體。相同DOX濃度條件下，DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA可以將進入細胞內(nèi)DOX量的80%遞送到A549細胞的線粒體，進入細胞內(nèi)DOX量的75%遞送到MDA-MB-231/ADR細胞的線粒體。當DOX劑量為10μmol/kg時，游離DOX和DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA對裸鼠移植瘤（MDA-MB-231/ADR細胞）的抑瘤率分別為22%和77%。與游離DOX組相比，DO

9、X/DQA-DOX@DSPE- hyd-PEG-AA給藥后DOX主要分布于腫瘤組織，少量分布在肝臟與心臟；HE染色結(jié)果表明，游離DOX給藥后，荷瘤裸鼠心肌組織形態(tài)變化明顯；DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA給藥后，荷瘤裸鼠心肌組織形態(tài)未見明顯變化。
　　3. LNPs的粒徑和載藥量分別為188 nm和5.4%。LNPs的體外釋藥具有pH依賴特性。體外抗腫瘤活性結(jié)果表明，LNPs可以濃度依賴性地抑制腫瘤細胞生長。

10、在DOX濃度為50μmol/L，LNPs處理A549細胞與MDA-MB-231/ADR細胞48 h后，細胞存活率分別為19%和29%。激光共聚焦顯微鏡觀察表明，LNPs進入細胞后，DOX首先分布于腫瘤細胞溶酶體，最終進入到線粒體。相同DOX濃度條件下，LNPs可以將進入細胞內(nèi)DOX量的81%遞送到A549細胞的線粒體，進入細胞內(nèi)DOX量的87%遞送到MDA-MB-231/ADR細胞的線粒體。當DOX劑量為10μmol/kg時，游離DOX

11、和LNPs對裸鼠移植瘤（A549細胞）的抑瘤率分別為53%和80%。LNPs給藥組 DOX主要分布于腫瘤組織，少量分布在腎臟。HE染色結(jié)果表明，游離 DOX給藥后，荷瘤裸鼠心肌組織形態(tài)變化明顯；LNPs給藥后，荷瘤裸鼠心肌組織形態(tài)未見明顯變化。
　　結(jié)論：
　　DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA以及 LNPs的體外釋藥具有酸敏特性。DOX/DQA-DOX@DSPE-hyd-PEG-AA以及LNPs可將DO