調(diào)控性RNAi系統(tǒng)構(gòu)建及靶向誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞凋亡對抗腫瘤免疫機(jī)制影響研究.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文調(diào)控性RNAi系統(tǒng)構(gòu)建及靶向誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞凋亡對抗腫瘤免疫機(jī)制影響研究姓名：劉淑鵬申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：孫樹漢20100501第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文RNA干擾(RNAi)是一種通過特定寡核苷酸序列靶向降解細(xì)胞中互補(bǔ)mRNA，進(jìn)而抑制基因在體內(nèi)和體外的表達(dá)的技術(shù)?，F(xiàn)在廣泛應(yīng)用的質(zhì)?；虿《据d體表達(dá)siRNA的方法，無法控制基因表達(dá)的空間及時(shí)間的特異性。這導(dǎo)致了各種調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建，應(yīng)用最廣泛的是

2、Tet調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)?；谝陨匣A(chǔ)，我們進(jìn)行了以下研究：第一部分，改建tet調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)。根據(jù)購自Clontech公司的Tcton調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)，在pTetOnAdvancedVector、pTREtightvector、pEGFPN1(AgeI位點(diǎn)突變?nèi)笔?及pLKOIpuro質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建單一質(zhì)粒的四環(huán)素調(diào)控表達(dá)質(zhì)粒pEGFPTctonTREsh。利用此質(zhì)粒進(jìn)行了后續(xù)的靶基因Oct4的RNAi干擾實(shí)驗(yàn)，并篩選了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。提高了體

3、內(nèi)實(shí)驗(yàn)過程中RNAi的干擾效率。第二部分在實(shí)驗(yàn)室前期工作的基礎(chǔ)上，檢測RNAi技術(shù)靶向Oct4誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞凋亡后，免疫狀態(tài)的改變。在試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，利用RNAi技術(shù)干擾Oct4表達(dá)致使腫瘤干細(xì)胞數(shù)目減少后，腫瘤微環(huán)境中IL4，ILl0和TGF13減少。為了進(jìn)一步確認(rèn)這是否導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中腫瘤免疫反應(yīng)增強(qiáng)，利用流式技術(shù)檢測腫瘤浸潤DC、CD4T及CDST細(xì)胞情況。發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞減少后，腫瘤浸潤的DC中matureDC的比例增加，CD4C