超抗原錨定的腫瘤細胞來源的exosomes高效誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答以及機制的研究.pdf

1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文超抗原錨定的腫瘤細胞來源的exosomes高效誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答以及機制的研究姓名：修方明申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：曹雪濤20050501浙江人學(xué)博士學(xué)位論文腫痛學(xué)床的exosomes。為了建立一個能夠大量制備exosomes的平臺，我們以小鼠胸腺瘤EG7細胞來源的exosomes為模型exosolnes進行了比較系統(tǒng)的實驗。EG7細胞是很好的一種模式細胞，EG7細胞是轉(zhuǎn)染了OVA基因的EL4細胞，能夠

2、分泌OVA，因此，OVA是一種很理想的模式抗原。Exsomes制備的前提是細胞的大量培養(yǎng)，EG7細胞是懸浮細胞，為此我們選用攪拌瓶培養(yǎng)，一只500ml的培養(yǎng)瓶就可以在一周的時間內(nèi)培養(yǎng)高達l礦數(shù)量級的細胞，相當(dāng)贏效。傳統(tǒng)的exosomes制備方法煩瑣、效率低下，而且得到的終產(chǎn)品exosomes純度也低。為了縮短exosomes的制備時間，我們用濾膜或者中空纖維器去除細胞，快速而且效率高：經(jīng)過超濾壓縮體積；密度梯度超離心純化等，一個制備過程

3、大約控制在6h之內(nèi)。這種不需要沉淀初步凈化初始培養(yǎng)上清的方法稱為非沉淀法，而傳統(tǒng)的則稱為沉淀法。我們對分離純化的exosomes進行了鑒定。電鏡下，這種顆粒直徑在40。100nm之間，具有清晰的雙層膜結(jié)構(gòu)，純度較好，滿布視野，雖然也發(fā)現(xiàn)纏繞一起的exosomes，但是在非沉淀制備方法比較少見，而且，富含HSP、HSC以及模擬抗原OVA等蛋白。Exosomes作為一種納米尺度的顆粒，具有納米顆粒的性質(zhì)。目前，納米級的材料的檢測，一般有電鏡

4、和粒徑兩類方法，兩者可以補充。雖然，電鏡可以觀察到顆粒大小和形狀，但沒有統(tǒng)計學(xué)上的意義；而粒徑除了能夠反映顆粒的大小外，它還能反映顆粒的分散度，具有統(tǒng)計學(xué)和整體上的意義。因此，我們提出測量exosowtes粒徑可以作為表征exosomes的一個很好的指標。我們的粒徑的檢測結(jié)果也與電鏡的結(jié)果吻合。Exosomes的定量，一般是測量exosomes所包含的總蛋白，但不能從功能上反映exo$omes的蛋白量。為此，我們通過測量EG7細胞分泌的