肝癌靶向性N-ras反義表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)人肝癌細(xì)胞系BEL-7402作用的研究.pdf

1、山東大學(xué)碩士學(xué)位論文肝癌靶向性Nras反義表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)人肝癌細(xì)胞系BEL7402作用的研究姓名：孔建平申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：免疫學(xué)指導(dǎo)教師：孫汶生2001.5.20山東大學(xué)碩士論文酶切鑒定插入方向，并進(jìn)行DNA測(cè)序和同源性分析。以陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)法將重組反義核酸表達(dá)載體轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞BEL一7402，并經(jīng)潮霉素B(100“g／m1)篩選，對(duì)抗性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，從而建立了Nras表達(dá)阻斷的穩(wěn)定的HygB抗性肝癌細(xì)胞株。通過(guò)流式細(xì)胞儀分

2、析，測(cè)定反義核酸對(duì)肝癌細(xì)胞靶基因表達(dá)、細(xì)胞周期的分布及細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果：將106kb的NraseDNA片段和去磷酸化修飾的載體pEBAF進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，隨機(jī)小量擴(kuò)增抽提質(zhì)粒，經(jīng)BamHI酶切，電泳證實(shí)目的基因成功插入。以隨機(jī)引物法制備的地高辛標(biāo)記N—raseDNA探針，其靈敏度測(cè)定為lpg。菌落原位雜交結(jié)果亦證實(shí)連接成功。載體pEBAF在NraseDNA插入位點(diǎn)下游125bp處有一PvuII切點(diǎn)，而Nras57端275bp處亦有同一酶

3、切位點(diǎn)。對(duì)初篩陽(yáng)性克隆用PvuII酶切鑒定，電泳如見到900bp和156kb為正向插入，如見到400bp和16Ikb為反向插入。兩者分別命名為pEBhF／sNras和pEBAF／as—Nras。將p朗AF／as—N—ras進(jìn)行測(cè)序和同源性分析，結(jié)果顯示該序列包括NraseDNA蛋白全部編碼區(qū)及其兩側(cè)部分具有轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控功能的非編碼序列，其中57端為61bp，37端為378bp。轉(zhuǎn)染反義表達(dá)載體pEBAF／as—N—ras的肝癌細(xì)胞N一