N-ras與epiregulin聯(lián)合干擾對肝癌細胞增殖的抑制效果研究.pdf

1、肝癌發(fā)生和發(fā)展具有復(fù)雜的分子機制，有許多癌基因和信號傳導(dǎo)通路參與其中，多靶點聯(lián)合治療可能為肝癌的治療提供一種新的途徑。RNA干擾可以實現(xiàn)多個靶點同時的特異性抑制，而且沒有傳統(tǒng)化學(xué)療法帶來的毒副作用，是一種有潛力的治療手段。基于本研究室在N—ras干擾治療肝癌研究的基礎(chǔ)上，尋找到一個參與N—ras干擾后的補償途徑調(diào)控基因epiregulin。該基因與N—ras基因聯(lián)合發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，對epiregulin與N—ras進行雙干擾，可以達到更好

2、的治療效果。 一、瞬時及穩(wěn)定干擾N—ras基因?qū)Ω伟┘毎鸋epG2基因表達譜的影響。 1.RT-PCR法和Western blot法檢測瞬時及穩(wěn)定干擾后N—RasRNA及蛋白水平的變化。結(jié)果顯示瞬時和穩(wěn)定干擾后，HepG2細胞中N—Ras的RNA以及蛋白水平相對于未處理以及mock處理組而言都有明顯的降低。灰度掃描結(jié)果顯示抑制率均約為60％。 2.芯片實驗檢測瞬時及穩(wěn)定干擾N—ras后變化的基因。與mock—si

3、RNA處理組相比，N—ras—siRNA處理24小時后上調(diào)的基因為185個(ratio>1.5)，下調(diào)的基因為206個(ratio<0.67)；N—Ras—siRNA干擾48小時后上調(diào)的基因為291個，下調(diào)的基因為248個：與HepG2/mock細胞相比，N—Ras穩(wěn)定干擾HepG2/N—ras(—)細胞上調(diào)的基因為482個，下調(diào)的基因的基因為524個。相對于瞬時干擾，穩(wěn)定干擾后基因表達變化的幅度大。 3.用DAVID生物信息學(xué)

4、資源數(shù)據(jù)庫進行基因功能富集分析。穩(wěn)定干擾N—ras后的功能富集分析中出現(xiàn)了cell motility，actin filament—based process，acin cytoskeleton organization and biogenesis等關(guān)鍵詞。瞬時干擾N—ras48小時后的功能富集分析中出現(xiàn)了regulation of epithelial cell proliferation，regulation of cell pr

5、oliferation，cell adhesion等關(guān)鍵詞。瞬時干擾N—ras24小時后的功能富集分析中出現(xiàn)了cell cycle，regulation of progression through cell cycle，regulation of cell cycle等關(guān)鍵詞。說明N—ras干擾后細胞周期、細胞增殖、細胞運動和細胞骨架等方面相關(guān)的基因發(fā)生了變化。 4.用Pathwayminer進行變化基因的通路分析。穩(wěn)定干擾N

6、—ras以及順時干擾N—ras48小時后，發(fā)生變化的通路相同，為focal adhesion，MAPK signaling pathway，regulation of actin cytoskeleton以及regulation of actin cytoskeleton，而瞬時干擾后24小時后變化的通路略有不同，依次為focal adhesion，cell cycle，MAPK signaling pathway以及wnt signa

7、ling pathway。 5.Gene Cluster 3.0以及Java TreeView對六張芯片結(jié)果進行了聚類分析。與穩(wěn)定干擾N—ras后的基因表達譜相比，瞬時干擾后的兩組芯片的基因表達譜更為接近。變化趨勢較為明顯的ClusterⅠ—Ⅳ主要參與的細胞生物學(xué)過程依次為angiogensis和growth，Catalytic activity，Inflammatory response和cell adhesion以及Secr

8、etory pathway。 6.用RT-PCR法驗證三組芯片結(jié)果。穩(wěn)定干擾N—ras變化的基因中驗證的有HDGFRP3，GPNMB，VRK1，MKI67，TM4SF3，EREG以及ACTG2。N—ras干擾48小時組中挑選的基因為ACTC和FN1，N—ras瞬時干擾24小時組中挑選的基因為EREG，芯片結(jié)果和RT-PCR結(jié)果較為符合。 7.觀察N—ras干擾對HepG2細胞形態(tài)的影響。N—ras—siRNA干擾HepG

9、2細胞后，細胞形態(tài)變得狹長，而mock—siRNA處理組的細胞形態(tài)沒有明顯的變化。 二、篩選與N—ras聯(lián)合干擾具有協(xié)同效果的基因。 1.RT-PCR法驗證ACTG2—siRNAs的干擾效果后，用SRB法檢測N—ras—siRNA與ACTG2—siRNA聯(lián)合干擾對HepG2細胞增殖的影響。結(jié)果表明，濃度為100nM的ACTG2—siRNA1或N—ras—siRNA干擾后細胞的存活率分別為43.5％和66.5％。將濃度減半

10、(各50nM)，聯(lián)合干擾后細胞的存活率為67.5％，比抑制單基因略高，提高濃度(各100nM)后，聯(lián)合干擾后細胞的存活率降為28％。ACTG2—siRNA2的情況與ACTG2—siRNA1大體相同。 2.RT-PCR法驗證EREG—siRNA的干擾效果后，用SRB法檢測N—ras—siRNA與EREG—siRNA聯(lián)合干擾對HepG2細胞增殖的影響。結(jié)果表明，濃度為100nM的EREG—siRNA1或N—ras—siRNA干擾后的

11、細胞存活率分別為49％和41％。將濃度減半(各50nM)，聯(lián)合干擾后細胞的存活率為36％，比抑制單基因有明顯降低，提高濃度(各100nM)后，聯(lián)合干擾后細胞的存活率降為15％。EREG—siRNA2的情況與EREG—siRNA1大體相同。進一步用SRB法檢測epiregulin受體EGFR的小分子抑制劑AG1478對N—ras干擾的細胞增殖抑制增效作用。結(jié)果表明與對照組和mock—siRNA干擾組相比，N—ras干擾組對AG1478更加

12、敏感。 3.RT-PCR法驗證R—ras—siRNAs的干擾效果后，用SRB法檢測N—ras—siRNA與R—ras—siRNAs聯(lián)合干擾對HepG2細胞增殖的影響。結(jié)果表明，濃度為100nM的R—ras—siRNA1或N—ras—siRNA干擾后細胞的存活率分別為43.5％和48％。將濃度減半(各50nM)，聯(lián)合干擾后細胞的存活率為39.5％，比抑制單基因有明顯降低，提高濃度(各100nM)后，細胞的存活率降為16％。

13、 4.RT-PCR法驗證TM4SF1—siRNA的干擾效果后，用SRB法檢測N—ras—siRNA與TM4SF1—siRNA聯(lián)合干擾對HepG2細胞增殖的影響。結(jié)果表明，干擾N—ras或TM4SF1后細胞的存活率分別為43.5％和65％。將濃度減半(各50nM)，細胞的存活率為66.5％，提高濃度(各100nM)后，細胞的存活率降為28.5％。 三、N—ras與epiregulin聯(lián)合干擾效果以及機理探討。 1.克隆形成

14、實驗檢測N—ras與epiregulin聯(lián)合干擾效果。結(jié)果表明N—ras—siRNA+EREG—siRNA1(各50nM)組與N—Ras—siRNA(100nM)以及EREG—siRNA1(100nM)組相比克隆形成數(shù)少量降低。N—Ras—siRNA+EREG—siRNA1(各100nM)與N—Ras—siRNA(100nM)以及EREG—siRNA1(100nM)組相比克隆形成數(shù)顯著降低。此結(jié)果與N—ras與epiregulin聯(lián)合干

15、擾的SRB實驗結(jié)果相符。 2.流式細胞術(shù)檢測N—ras以及epiregulin干擾對細胞周期分布的影響。結(jié)果表明，干擾N—ras與epiregulin均可增加G0/G1期細胞，降低S期細胞。與對照細胞相比，干擾N—ras或epiregulin使G0/G1期細胞分別增加了14.7％和11.9％。聯(lián)合干擾N—ras和epiregulin使G0/G1期細胞增加到20.4％。結(jié)果證明單干擾N—ras或epiregulin均可造成一定的G

16、0/G1期阻滯，而聯(lián)合干擾會增強這種效應(yīng)。 3.Western blot檢測N—ras以及epiregulin聯(lián)合干擾對MAPK以及PI3K—Akt通路蛋白的影響。實驗表明，干擾N—ras或epiregulin均可使ERK1/2和Akt的磷酸化水平降低，而總ERK1/2及Akt蛋白水平保持不變。干擾N—ras或epiregulin也可使c—myc蛋白表達降低。聯(lián)合干擾N—ras和epiregulin會增強上述效應(yīng)。 4.

17、Western blot檢測N—ras以及epiregulin聯(lián)合干擾對G1期蛋白的影響。實驗結(jié)果表明，干擾N—ras或epiregulin均可降低Rb的磷酸化水平以及cyclinD1蛋白的表達水平，升高p21的表達水平。聯(lián)合干擾N—ras和epiregulin會增強上述效應(yīng)。這個結(jié)果支持了第2部分的實驗結(jié)果，并進一步證明聯(lián)合干擾N—ras和epiregulin可以通過對G0/G1期的阻滯來發(fā)揮作用。 綜上所述，基因芯片結(jié)果表明