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文檔簡介
1、Bevacizumab是針對血管內皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)人工合成的一種重組人源化單克隆抗體。目前已被美國FDA批準為轉移性結直腸癌的一線、二線治療,非小細胞肺癌的一線治療,轉移性HER2陰性乳腺癌的治療。近期多項研究Bevaeizumab對肝癌的臨床療效的I期、II期臨床試驗的結果表明Bevacizumab單藥以及聯(lián)合其他化療藥物或分子靶向藥物都有一定的抗腫瘤療效。
2、 目前,單藥Bevacizumab抗腫瘤治療已有一定的療效,但是多項臨床前實驗證明了Bevacizumab聯(lián)合化療藥物治療腫瘤比其單藥治療療效好。近年世界上多個國家都在進行吉西他濱治療肝癌的臨床研究,但其單藥有效率在20%以下。而Bevacizumab可增加傳統(tǒng)化療藥物治療實體瘤的療效,包括結腸癌和非小細胞肺癌。近期也有多項臨床研究證明了Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱或其他化療藥物治療肝癌的有效性。 因此,本研究旨在探討B(tài)e
3、vacizumab對人肝癌細胞的增殖影響及機制,Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱對荷肝癌裸鼠的治療作用。 第一部分:肝癌細胞中血管內皮生長因子自分泌機制的實驗研究 一、研究方法和內容: 1、采用RT—PCR、免疫細胞化學的方法分析肝癌細胞株中VEGF、Flt-1、KDR基因和蛋白水平的表達:選用兩株肝癌細胞株HepG2、SMMC—7721,內皮細胞系ECV304作為VEGF受體表達的陽性對照,從中篩選VEGFm
4、RNA表達量高,F(xiàn)lt-1、KDR均為陽性表達的肝癌細胞株,采用獨立樣本t檢驗統(tǒng)計分析。 2、外源性rhVEGF對肝癌細胞的影響:無血清條件下,12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/mlrhVEGF作用于肝癌細胞株HepG2細胞72h后,行MTT檢測其增殖情況,并用單因素方差分析不同濃度rhVEGF對肝癌細胞株的促進增殖作用;通過RT—PCR檢測100ng/mlrhVEGF作用肝癌細胞后VEGF、Flt
5、-1、KDRmRNA的表達量,與空白對照組比較采用獨立樣本t檢驗。 二、主要結果: 1、RT—PCR結果示:肝癌細胞株HepG2中均有VEGF、Flt-1、KDRmRNA的表達,而SMMC—7721中只有VEGF、Flt-1mRNA的表達;且HepG2中VEGF、Flt-1mRNA的表達量均高于SMMC—7721(VEGFmRNA:t=9.056,P=0.001;Flt-1mRNA:F=55.975,P=0.000);免
6、疫細胞化學結果示:HepG2見VEGF、Flt-1及KDR的表達,SMMC—7721見VEGF、Flt-1的表達,無KDR的表達。因此,我們選用VEGF高表達和Flt-1、KDR均表達的HepG2細胞作為研究Bevacizumab對肝癌細胞直接作用的實驗用細胞。 2、不同濃度rhVEGF對肝癌細胞株HepG2均有促進增殖的作用,12.5ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml組OD值與對照組差異均有統(tǒng)計學意義
7、(P值分別為0.023,0.002,0.000,0.000)。在25~100ng/ml范圍內其促進作用隨rhVEGF濃度的增高而增強;其VEGF、KDRmRNA表達量均增加(t值分別為:22.450和9.086,P值分別為:0.000和0.001),而Flt-1mRNA表達量無明顯變化(t=1.225,P=0.288)。 三、主要結論: 1、人肝癌細胞株中存在VEGF及其受體的共同表達。 2、rhVEGF對肝癌細
8、胞株HepG2有促進增殖的作用,且呈劑量依賴性,此作用可能是通過KDR介導的,同時隨著腫瘤細胞的增殖,其VEGF進一步表達,從而使得VEGF和其受體KDR的相互作用加強。 3、肝癌細胞中可能存在VEGF的自分泌機制,且該機制是通過KDR介導的。 第二部分:Bevacizumab直接抑制肝癌細胞體外增殖的實驗研究 一、研究方法和內容: 1、MTT法檢測Bevacizumab對肝癌細胞的增殖抑制作用:無血清條
9、件下,0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、20μg/mlBevacizumab作用于HepG2細胞48h,采用單因素方差分析(LSD法)比較不同濃度間及與對照組的增殖情況。 2、AnnexinV—FITC/PI雙染檢測細胞凋亡:無血清條件下,10μg/mlBevacizumab作用于HepG2細胞48h后,經AnnexinV—FITC/PI雙染,流式細胞儀檢測凋亡情況。采用獨立樣本t檢驗比較Bevacizumab組和
10、對照組。 3、流式細胞儀分析細胞周期變化:無血清條件下,10μg/mlBevacizumab作用于HepG2細胞48h后,PI染色,流式細胞儀檢測,計算各期細胞所占比例。采用獨立樣本t檢驗比較Bevacizumab組和對照組。 4、RT—PCR分析肝癌細胞株VEGF、Flt-1、KDRmRNA表達量的變化:無血清條件下,10μg/mlBevacizumab作用于HepG2細胞48h后,行RT—PCR檢測。采用獨立樣本t檢
11、驗比較Bevacizumab和對照組。 二、結果: 1、不同濃度Bevacizumab對肝癌細胞株HepG2的增殖有抑制作用。0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml組細胞增殖抑制率分別為8.8%、27%、32%、26%。其中1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值分別為0.001,0.000,0.001),但此三組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
12、 2、Bevacizumab可誘導肝癌細胞株HepG2的凋亡。Bevacizumab組的細胞凋亡率為(17.04±0.14)%,明顯高于對照組(2.85±0.08)%(t=198.533,P=0.000)。 3、Bevacizumab可引起肝癌細胞株HepG2的細胞周期變化。其中,S期細胞無明顯變化(t=0.477,P=0.646);G1期的細胞增加(t=13.457,P=0.000),G2期的細胞減少(t=16.787,P=
13、0.000),差異均有統(tǒng)計學意義。 4、Bevacizumab作用于肝癌細胞株HepG2后,其VEGF、KDRmRNA表達量均減少,與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(t值分別為:12.476和5.071,P值分別為:0.000和0.007);而Flt-1mRNA表達量與空白對照組比較無顯著差異(t=2.449,P=0.07)。 三、結論: 1、Bevacizumab作用于肝癌細胞株HepG2后,細胞增殖受抑,細胞
14、凋亡率增高。 2、Bevacizumab對HepG2的增殖抑制作用可能是通過KDR介導的,同時隨著腫瘤細胞的增殖抑制,其VEGF表達量減少。 3、Bevacizumab可能通過阻滯VEGF的自分泌作用而發(fā)揮對肝癌細胞的增殖抑制作用。 第三部分:Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱對荷肝癌裸鼠的治療作用研究 一、研究方法和內容: 建立人肝癌細胞HepG2裸鼠移植瘤模型,每隔3天觀察一次,用游標卡尺測量
15、腫瘤的大小,當腫瘤直徑長至0.4~0.6cm時,即用于實驗。實驗分A組:空白對照組,予以無菌生理鹽水,0.2ml/只;B組:Bevacizumab組,5mg/kg;C組:吉西他濱組,100mg/kg;D組:Bevacizumab5mg/kg+吉西他濱100mg/kg聯(lián)合組。各組給藥均為2次/周,共4周,腹腔注射。自接種后第19天起,每周檢測腫瘤體積。連續(xù)給藥4周后停藥一周,處死裸鼠,取移植瘤組織進行CD34染色檢測各組微血管密度(MVD
16、)。對照組與各治療組間移植瘤體積比較采用重復測量數(shù)據的方差分析;對照組與各治療組間MVD的比較采用單因素方差分析。 二、主要結果: 1、各治療組給藥后體積與對照組相比增長均較緩慢,Bevacizumab組、吉西他濱組、Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱組的抑瘤率分別為40.35%、45.61%、84.21%,其中Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱組最為明顯。Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱與Bevacizumab、吉西
17、他濱組之間均有顯著差異(P值分別為0.004,0.010)。 2、與對照組比較,單藥吉西他濱組MVD無顯著差異(P=0.267);單藥Bevacizumab組及聯(lián)合吉西他濱組的MVD均減少,與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P值均為0.000);Bevacizumab聯(lián)合吉西他濱組的MVD減少較Bevacizumab組更為顯著,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。 三、結論: 1、Bevacizumab可抑制荷肝癌
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