Nutlin-3逆轉吉西他濱耐藥肝癌細胞發(fā)生上皮間質樣轉化的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　我國是肝癌的“重災國”。晚期肝癌的治療一直以來是臨床中亟需予以克服的難題。分子靶向藥物索拉非尼（Sorafenib）是晚期肝癌的標準治療，但只有中等程度的獲益。近年來，以吉西他濱（Gemcitabine，GEM）和奧沙利鉑（Oxaliplatin， OXA）為代表的新型細胞毒藥物在晚期肝癌的治療上顯示出良好的前景。然而，獲得性耐藥仍然是制約此類藥物在晚期肝癌中發(fā)揮最大效能的主要因素。
　　為了探索肝癌的

2、耐藥機制以及尋求克服耐藥的治療策略，在既往研究中我們建立了GEM耐藥肝癌模型，發(fā)現GEM耐藥肝癌細胞發(fā)生了上皮間質樣轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT），進一步研究表明EMT的發(fā)生可能是肝癌細胞對GEM產生耐藥的主要機制。本研究在前期研究基礎上，探討Nutlin-3對GEM耐藥肝癌細胞發(fā)生EMT的逆轉作用及其分子機制，為以逆轉EMT信號通路為靶點克服耐藥應用于臨床提供新的理論基礎。
　

3、　方法：
　　1.在既往已經建立的肝細胞癌HepG2和SMMC-7721的GEM耐藥細胞模型（以下簡稱“HepG2 GR”和“SMMC-7721 GR”細胞）基礎上，采用MTT法檢測Nutlin-3對HepG2 GR和SMMC-7721 GR細胞的敏感性并繪制增殖曲線。
　　2.觀察Nutlin-3干預HepG2 GR和SMMC-7721 GR細胞后發(fā)生的形態(tài)學改變，并通過細胞劃痕、遷移侵襲、粘附和分離實驗考察干預前后生物學

4、活性的變化。
　　3.利用實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）和蛋白質印跡法（Western-Blot）檢測Nutlin-3干預HepG2 GR和SMMC-7721 GR細胞前后EMT分子表型E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Snail和Slug的表達情況。
　　4.在肝癌親本（HepG2和SMMC-7721）和GEM耐藥肝癌細胞（Hep

5、G2 GR和SMMC-7721 GR）中，以qRT-PCR、Western-Blot法檢測GEM耐藥肝癌細胞發(fā)生EMT過程中Smad2的mRNA水平和蛋白表達；Nutlin-3干預GEM耐藥肝癌細胞，以qRT-PCR、Western-Blot法檢測Smad2 mRNA水平和蛋白表達情況。
　　5.在HepG2 GR中，通過Smad2 siRNAs瞬時沉默Smad2基因表達，驗證干擾效率后，以qRT-PCR、Western-Blot

6、法測定E-cadherin、Vimentin、Snail和Slug的表達，考察Smad2瞬時沉默對GEM耐藥肝癌細胞EMT分子表型的影響。
　　6.在HepG2 GR中，轉染Smad2 siRNA1后，通過形態(tài)學觀察、遷徙侵襲、劃痕實驗、細胞粘附和分離實驗，考察Smad2瞬時沉默對耐藥肝癌細胞EMT生物學特征的影響。
　　結果：
　　1.Nutlin-3對GEM耐藥肝癌細胞（HepG2 GR和SMMC-7721 GR）

7、的增殖產生抑制作用。
　　2.Nutlin-3干預GEM耐藥肝癌細胞（HepG2GR和SMMC-7721 GR）后，發(fā)生了形態(tài)學改變，細胞極性逐漸恢復、偽足減少，細胞呈卵圓形，且聚集生長。
　　3.Nutlin-3干預GEM耐藥肝癌細胞（HepG2 GR和SMMC-7721GR）后，耐藥細胞運動能力減弱，侵襲能力下降。
　　4.Nutlin-3可逆轉GEM耐藥肝癌細胞（HepG2 GR和SMMC-7721 GR）EMT

8、分子表型，EMT分子表型E-cadherin表達上調，Vimentin、Snail、Slug表達下調。
　　5.Smad2在GEM耐藥肝癌細胞（HepG2GR和SMMC-7721 GR）中較親本細胞顯著高表達，Nutlin-3可下調GEM耐藥肝癌細胞中Smad2表達。
　　6.瞬時沉默GEM耐藥肝癌細胞（HepG2 GR）中Smad2表達，可逆轉HepG2 GR細胞EMT分子表型，改變HepG2 GR細胞生物學特性。