17AAG對肝癌細胞增殖轉移的抑制及其機制的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是目前世界上常見的惡性腫瘤之一，對化療和放療均不敏感，手術根治率低，容易發(fā)生早期轉移和術后復發(fā)、轉移，因此尋求肝腫瘤的靶向藥物是當前研究的熱點之一。
　　近年來有研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白在肝癌中過度表達，并且牽涉腫瘤增殖、分化、侵襲、轉移及死亡。17AAG(17-allylamino-demethoxy geldanamycin)屬于苯醌類安沙霉素，能夠與ATP競爭熱

2、休克蛋白90(heat shock protein90，HSP90)N-末端區(qū)域的核苷酸連接位點，以更高的親和力與HSP90保守的N末端區(qū)域結合，這種結合抑制了底物蛋白的結合，從而抑制HSP90的ATP酶活性，并通過泛素蛋白酶途徑使許多客戶蛋白發(fā)生降解，發(fā)生細胞周期捕獲和凋亡。與惡性腫瘤相關的HSP90客戶蛋白包括ErbB2，Bcr-abl，estrogen receptors，androgenreceptors，c-RAF-1，CDK

3、4，AKT，mutant p53，MET，h-TERT和HIF-1α等，因為這些癌性“客戶蛋白”與許多腫瘤惡性特征有關，如使信號調節(jié)失調、細胞周期進展、凋亡、永生化、血管生成、侵襲和轉移等，因此抑制HSP90將會對癌癥表型起著聯(lián)合阻斷作用。
　　本研究將17AAG作用于不同起源的肝癌細胞，探索17AAG作用后熱休克因子、熱休克蛋白和HSP90客戶蛋白表達的變化，觀察17AAG對不同起源肝癌細胞增殖抑制及其轉移能力的影響，進而探索1

4、7AAG在肝癌中的作用機制，為其進一步應用于臨床提供了一定依據。
　　第一部分17從G對肝癌細胞增殖侵襲轉移的抑制作用
　　目的：探索17AAG對正常肝臟細胞及不同起源肝癌細胞的增殖抑制、誘導凋亡，以及侵襲和轉移能力的抑制作用。
　　方法：通過MTT法、軟瓊脂集落形成及檢測細胞周期觀察17AAG對細胞增殖能力的影響，通過流式細胞儀、Hoechst染色、PI/AnnexinⅤ雙染色檢測凋亡，應用劃痕實驗和Transwel

5、l實驗檢測侵襲轉移能力的變化，并在荷瘤裸鼠體內觀察17AAG對肝癌細胞增殖能力和轉移能力的抑制作用。
　　結果：17AAG對HL7702正常肝臟細胞生長無抑制作用，對其細胞周期及侵襲能力無影響，也不誘導凋亡。17AAG對肝母細胞瘤起源的HepG2細胞和原發(fā)性肝癌起源的MHCC-97H細胞生長均有抑制作用，影響細胞周期，降低其離散和侵襲能力，并誘導凋亡，能抑制兩株腫瘤細胞在裸鼠中皮下移植瘤的生長，并降低其肺、肝轉移發(fā)生率。
　

6、　結論：適合劑量(1μ M)的17AAG對MHCC-97H細胞和HepG2細胞均具有增殖抑制、誘導凋亡和降低侵襲轉移能力的作用，而對HL-7702正常肝臟細胞則無生長抑制及誘導凋亡的作用。因此，為17AAG應用于肝癌的臨床研究提供了一定的依據。
　　第二部分17AAG影響熱休克蛋白及HSP90客戶蛋白的表達
　　目的：觀察17AAG作用后熱休克因子-1(HSF-1)、熱休克蛋白(HSP27，HSP70和HSP90)表達的變化

7、，以及對其靶點HSP90客戶蛋白c-Met，AKT和c-Met信號傳導通路相關因子表達的影響。
　　方法：17AAG作用于正常肝臟細胞HL7702、低轉移潛能HepG2和高轉移潛能MHCC-97H，提取細胞總蛋白，用BCA法蛋白定量，Western blot方法檢測HSF-1、熱休克蛋白和HSP90客戶蛋白表達的變化。
　　結果：三株細胞中均可見HSF-1被誘導上調表達，除HepG2細胞低表達HSP27，17AAG作用后HS

8、P27、HSP70和HSP90表達均升高，且有隨著作用時間的延長而增加的趨勢。HepG2細胞和MHCC-97H細胞均高表達c-Met，PI3K，AKT和GSK-3β，但c-Met，PI3K，AKT隨著作用時間的延長而表達下降，而在HepG2細胞中GSK-3β則隨著作用時間的延長表達有所上升。HL7702細胞中雖可見c-Met，PI3K，AKT和GSK-3β有所表達，但17AAG對其表達并無影響。
　　結論：17AAG不但能夠抑制H

9、SP90客戶蛋白c-MET和AKT的表達，而且能夠抑制c-Met信號傳導通路中相關因子的表達，17AAG對正常肝臟細胞中HSP90客戶蛋白表達無影響，因此17AAG可通過抑制其靶點HSP90客戶蛋白的表達而發(fā)揮其抑制腫瘤侵襲和轉移的作用。HSP27低表達的肝癌細胞對17AAG更敏感，提示HSP27表達水平可作為評價腫瘤細胞對17AAG敏感性的一個生物學指標。
　　第三部分下調HSP27表達對17AAG藥物敏感性的影響
　　目

10、的：應用siRNA作用于HSP27高表達的MHCC-97H肝癌細胞，觀察下調HSP27表達后能否提高肝癌細胞對17AAG的敏感性。
　　方法：MTT法檢測轉染前后MHCC-97H細胞IC50的變化，提取總蛋白，應用BCA法蛋白定量，Western blot方法檢測HSP27、HSP70和HSP90轉染前后表達的變化，并檢測HSP90客戶蛋白c-Met和AKT表達的變化。
　　結果：轉染后IC50值下降，MHCC-97H細胞轉

11、染前后IC50分別為3.3434±0.1973μM和1.2297±0.1208μ M(p<0.01)。siRNA轉染后細胞中HSP27表達有所下降，而HSP70和HSP90表達仍然上升，HSP90客戶蛋白c-Met和AKT的表達仍是受抑制的。
　　結論：抑制肝癌細胞HSP27的表達，可增加腫瘤細胞對17AAG的敏感性。轉染后HSP27表達下降，但并不影響HSP70、HSP90和HSP90客戶蛋白的表達，說明IC50的下降僅與抑制H

12、SP27表達有關。
　　第四部分SMMC/SF7721肝癌細胞中17從G對其增殖轉移的抑制及機制研究
　　目的：探索17AAG對來自同一親本SMMC7721與SF7721肝癌細胞的增殖抑制、誘導凋亡，以及侵襲和轉移能力的抑制作用。觀察在SMMC/SF7721細胞中17AAG對熱休克蛋白及其靶點HSP90客戶蛋白表達的影響，并進行機制的探討。
　　方法：MTT法觀察細胞對17AAG增殖能力的影響，Transwell實驗檢

13、測細胞侵襲能力的變化，流式細胞儀(FCM)和PI/AnnexinⅤ方法檢測凋亡。siRNA轉染細胞降低HSP27表達后，應用western blot方法檢測轉染前后細胞中HSP27、HSP70、HSP90及其HSP90客戶蛋白表達的變化。
　　結果：17AAG能夠抑制SMMC/SF7721肝癌細胞的生長、抑制其侵襲能力并誘導凋亡。17AAG作用于SMMC/SF7721細胞后可誘導HSF-1上調，進而促進HSP27、HSP70和HS

14、P90的表達，SF7721細胞中c-met的表達明顯高于SMMC7721，但17AAG仍然能夠抑制其靶點HSP90客戶蛋白的表達，如c-met、AKT等，在SMMC/SF7721細胞中均高表達HSP27，應用siRNA技術下調HSP27表達后可提高17AAG的敏感性，且不受HSP70、HSP90及HSP90客戶蛋白表達的影響。SMMC7721細胞中17AAG加control-siRNA或HSP27-siRNA的IC50值分別為(4.33

15、58±0.1184)μM和(1.4447±0.1199)μ M(p<0.01)，SF7721細胞中17AAG加control-siRNA或HSP27-siRNA的IC50值分別為(2.7240±0.1137)μ M和(1.1692±0.1016)μ M(p<0.01)。
　　結論：在c-met高表達的SF7721細胞中17AAG仍可抑制肝癌細胞的生長增殖，抑制其侵襲轉移能力，因此17AAG是通過抑制其靶點HSP90客戶蛋白的表達而

16、發(fā)揮抗腫瘤作用，同時靶向抑制HSP27的表達仍可提高17AAG的敏感性。
　　總結
　　本研究中17AAG對正常肝臟細胞無生長抑制及誘導凋亡的作用，而對不同起源的肝腫瘤細胞具有生長抑制作用，影響細胞周期，降低其離散和侵襲能力，并誘導凋亡，腫瘤細胞接種于裸鼠后形成皮下移植瘤，17AAG抑制裸鼠皮下移植瘤的生長，并降低其肺、肝轉移發(fā)生率。17AAG作用于正常肝臟細胞后上調熱休克蛋白的表達，但對其靶點HSP90客戶蛋白表達并無影響

17、，17AAG作用于低轉移潛能肝癌細胞HepG2和SMMC7721以及高轉移潛能肝癌細胞MHCC-97H和SF7721后上調熱休克蛋白的表達，同時抑制其靶點HSP90客戶蛋白的表達。低表達HSP27的Hep62細胞IC50值低，在HSP27高表達的細胞中應用siRNA抑制HSP27表達后可提高對17AAG的敏感性，而且并不影響其它熱休克蛋白和IHSP90客戶蛋白的表達。研究提示17AAG對正常肝臟細胞的增殖無明顯影響，對肝癌細胞的抑制作用