新型PPARγ激動劑對人腎癌細胞增殖抑制及其機制的研究.pdf

1、研究目的:
　　過氧化物酶體增生物激活受體γ(peroxisome proliferator-actived receptorsgamma，PPARγ)屬于核受體超家族一份子，表達于心、肝、腎、骨骼肌、卵巢和胎盤等多種人體組織中。自從上個世紀以來，以PPARγ為靶點的藥物，尤其是噻唑烷二酮類PPARγ激動劑(TZDs)，為糖尿病的臨床預(yù)防和治療提供了新的思路。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ除了對人體的糖脂代謝具有重要意義外，還與肺，乳

2、腺，結(jié)腸，前腺、膀胱和腎臟等部位的腫瘤關(guān)系密切。在腎癌中，PPARγ激動劑能夠顯著抑制腎癌細胞增殖，減輕化療藥的腎毒性，有望成為臨床治療腎癌的新藥。然而，自TZDs類藥物上市以來，其肝毒性、致水鈉潴留及增加心衰發(fā)生率等嚴重副作用限制了該類藥物的長期使用。因此，尋找取代TZD類的新型PPARγ激動劑，對于腎癌的藥物研發(fā)具有非常重要的現(xiàn)實意義。為此，與中科院上海藥物研究所合作，通過計算機虛擬篩選方法獲得的1種新型PPARγ激動劑DH9。前期

3、體外腫瘤學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，DH9的PPARγ受體激動能力較弱，但卻顯示出比TZDs類更強的抗腫瘤活性。荷瘤裸鼠模型(MGC-803、NCI-H460)上研究進一步發(fā)現(xiàn)，化合物DH9對體重及重要臟器影響較小，適合長期給藥，具有治療腎癌的潛在優(yōu)勢，值得進一步探索研究。
　　本研究利用體外培養(yǎng)的腎癌細胞系OS-RC-2細胞，探討新型PPARγ激動劑DH9能否在體外發(fā)揮較強的抗腎癌細胞活性，并在此基礎(chǔ)上進一步探究其作用機制，為將來臨床上開發(fā)更加

4、安全有效的抗腎細胞癌新藥夯實理論基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1.予不同濃度的DH9（0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L）或羅格列酮(0、25、50、100、150和200μmol/L)分別干預(yù)人腎癌OS-RC-2細胞24、48和72小時，MTT檢測OS-RC-2細胞增殖情況。采用相同濃度(0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L)的DH9和羅格列酮干預(yù)OS-RC-2細胞48小時，MTT檢測細

5、胞增殖情況。
　　2.予PPARγ特異性拮抗GW9662預(yù)處理人腎癌OS-RC-2細胞2小時，再加入不同濃度的DH9（0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L）干預(yù)48小時，MTT檢測GW9662干預(yù)前后DH9增殖抑制率的變化。為進一步驗證PPARγ非依賴途徑參與DH9增殖抑制過程，應(yīng)用siRNA技術(shù)抑制PPARγ基因在OS-RC-2細胞內(nèi)的表達。PPARγ siRNA轉(zhuǎn)染48小時后收集全細胞裂解物，Western印

6、跡法觀察細胞PPARγ表達的改變。予不同濃度DH9（0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L）干預(yù)OS-RC-2細胞48小時，MTT檢測轉(zhuǎn)染前后細胞增殖情況。
　　3.應(yīng)用流式細胞技術(shù)，觀察不同濃度DH9(0、20、40和80μmol/L)作用人腎癌OS-RC-2細胞48小時后細胞周期的改變，Western印跡法檢測細胞周期相關(guān)蛋白P27 KIP1及CyclinD1的變化;采用AnnexinⅤ-FI℃/PI雙染色流式

7、細胞術(shù)，測定不同濃度DH9(0、20、40和80μmol/L)干預(yù)下細胞凋亡率，Wes tern印跡法分析凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達。
　　研究結(jié)果:
　　1.MTT結(jié)果顯示，羅格列酮抑制OS-RC-2細胞增殖的起效濃度高，起效時間滯后，作用48小時后才能發(fā)揮其增殖抑制效應(yīng)(P＜0.05)。而DH9的起效濃度較低，作用24小時即可起效，48小時后可顯著抑制腎癌細胞增殖。此外，相同濃度的羅格列酮及DH9(0、6.25

8、、12.5、25、50和100μmol/L)干預(yù)OS-RC-2細胞48小時，DH9的增殖抑制作用明顯優(yōu)于羅格列酮(P＜0.05)。
　　2.GW9662預(yù)處理人腎癌OS-RC-2細胞增殖2小時后，再予不同濃度DH9作用48小時，MTT結(jié)果顯示PPARγ特異性拮抗劑不能拮抗DH9的增殖抑制效應(yīng)(P＞0.05)。取不同濃度DH9(0、6.25、12.5、25、50和100μmol/L)處理轉(zhuǎn)染前后的OS-RC-2細胞48小時，MTT結(jié)

9、果顯示PPARγ小干擾RNA表達質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對藥物的增殖抑制的影響無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.流式細胞術(shù)顯示，不同濃度(20、40和80μmol/L) DH9干預(yù)48小時后可干擾細胞周期。與對照組(0μmol/L)相比，DH9可導(dǎo)致G0/G1期細胞大量增加(P＜0.05)，S期細胞大量減少(P＜0.05），且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，而G2/M期細胞無明顯變化(P＞0.05)。Western印跡分析顯示，隨DH9干預(yù)濃度的

10、升高，G1期相關(guān)的cyclinD1蛋白表達逐漸減弱，而P27 KIP1蛋白表達逐漸增強。
　　4.AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，DH9可以誘導(dǎo)細胞凋亡。濃度為20μM、40μM和80μM的DH9作用OS-RC-2細胞48小時，凋亡率依次為為4.34±0.97％，13.52±0.87％和23.69±1.9％，顯著高于對照組1.81±0.14％(P＜0.05)，且與藥物濃度之間存在一定的依賴關(guān)系。Weste