針對(duì)XIAP基因shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建針對(duì)人XIAP基因的小干擾RNA表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞，觀察其對(duì)XIAP mRNA表達(dá)及對(duì)Hela細(xì)胞凋亡和周期的影響。研究不僅為針對(duì)XIAP基因的RNA干擾提供新的有效的作用靶位，而且為體內(nèi)表達(dá)載體介導(dǎo)的RNA干擾作為一種有效的基因沉默技術(shù)的應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為針對(duì)凋亡抑制基因XIAP的宮頸癌基因治療提供新的途徑，同時(shí)也對(duì)RNA干擾技術(shù)在腫瘤研究和基因治療方面應(yīng)用的可能性進(jìn)行有益的探索。

2、 方法：研究對(duì)象為人宮頸癌HeLa細(xì)胞株。（1）構(gòu)建針對(duì)XIAP的表達(dá)載體pGPU6—GFP—XIAP—shRNA。（2）培養(yǎng)HeLa細(xì)胞通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，并設(shè)置空白對(duì)照組（Blank）、轉(zhuǎn)染試劑組（mock）、陰性組（NC）、干擾組（pGPU6—GFP—XIAP—shRNA）組。（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組XIAP mRNA的相對(duì)表達(dá)量。（4）同時(shí)應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和PI單染檢測(cè)細(xì)胞周期。 結(jié)果：（1）p

3、GPU6一GFP—XIAP—shRNA質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，同時(shí)測(cè)序鑒定也證實(shí)目的序列已準(zhǔn)確插入到預(yù)計(jì)位點(diǎn)，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。（2）實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示pGPU6—GFP—XIAP—shRNA轉(zhuǎn)染48h和72h后HeLa細(xì)胞中XIAP mRNA的表達(dá)量下降27%和51%，與空白組相比有差異（P<0．05）。而且在48h至72h期間，干擾片段沉默效應(yīng)呈趨勢(shì)增強(qiáng)，XIAP基因mRNA的表達(dá)量呈遞減趨勢(shì)。（3）流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在48h和

4、72h XIAP—shRNA組細(xì)胞凋亡率（31．60±1．29%和37．43±1．94%）與Blank對(duì)照組（1．58±1．34%和2．12±1．44%）、mock組（4．19±1．64%和4．87±1．50%）、NC組（4．58±1．63%和5．15±1．82%）相比細(xì)胞凋亡率顯著增加（P<0．05）。（4）PI單染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)染XIAP—shRNA組的HeLa細(xì)胞周期發(fā)生改變，轉(zhuǎn)染后G0/G1期細(xì)胞顯著增加，與B

5、lank組相比出現(xiàn)G0/G1期阻滯現(xiàn)象，G0/G1期升高而S期下降（P<0．05）： 結(jié)論：（1）針對(duì)XIAP基因設(shè)計(jì)合成的shRNA干擾片段準(zhǔn)確地克隆到pGPU6—GFP表達(dá)載體中，說(shuō)明表達(dá)載體構(gòu)建成功。（2）應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑能高效地將重組載體轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞，從而保證了重組載體在細(xì)胞內(nèi)高效地表達(dá)。（3）針對(duì)XIAP基因shRNA的能夠在HeLa中成功發(fā)揮特異、有效的基因沉默作用。可明顯降低宮頸癌HeLa細(xì)胞XIAP基因m