p38δ影響宮頸癌Hela細胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的：本課題旨在探討p38δ在宮頸癌組織細胞和Hela細胞系中蛋白表達水平的變化，及p38δ高表達對Hela細胞凋亡的影響，同時初步探討p38δ在該調(diào)控過程中可能存在的分子機制，從而為宮頸癌的篩查、診斷及臨床治療提供新的思路。
　　方法：
　　1.利用蛋白免疫印跡（western blot）法檢測宮頸癌組織細胞及Hela細胞系中p38δ蛋白表達水平；
　　2.利用瞬時轉染p38δ哺乳動物表達質(zhì)粒，在Hela細胞中瞬時過

2、表達p38δ；
　　3.利用Annexin V-FITC/PI雙染色熒光顯微鏡觀察法檢測Hela細胞瞬時過表達p38δ后細胞凋亡水平的變化；
　　4.利用慢病毒轉染及細胞耐藥性篩選構建穩(wěn)定表達p38δHela細胞株；
　　5.利用蛋白免疫印跡法和細胞免疫熒光染色法檢測穩(wěn)定表達p38δ Hela細胞株中p38δ的表達情況；
　　6.利用Annexin V-FITC/PI雙染色熒光顯微鏡觀察法檢測對照Hela細胞株和

3、穩(wěn)定表達p38δ Hela細胞株在缺氧條件（1％O2，24h）和順鉑處理條件（10ug/ml，24h）下細胞凋亡水平；
　　7.利用免疫沉淀（immunoprecipitation）法和蛋白免疫印跡法檢測缺氧條件（1%O2，24h）和順鉑（10ug/ml，24h）處理條件下p38δ磷酸化水平；
　　8.利用瞬時轉染野生型p38δ表達質(zhì)粒和激酶失活突變體p38δ(K54R)表達質(zhì)粒，以及Annexin V-FITC/PI雙染色

4、熒光顯微鏡觀察法，檢測野生型p38δ和激酶失活突變p38δ(K54R)對Hela細胞凋亡的影響；
　　9.采用蛋白免疫印跡法檢測對照Hela細胞株和穩(wěn)定表達p38δ Hela細胞株在缺氧條件（1% O2，24h）和順鉑處理條件（10ug/ml，24h）下，細胞中凋亡調(diào)控因子p53、Bcl-2及Bax的表達水平。
　　結果：
　　1.與正常宮頸組織相比，宮頸癌組織中p38δ蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.

5、05）；與非癌性細胞系HEK293(human embryonic kidney293)細胞、MEF(Mouse embryo fibroblast)細胞相比，宮頸癌細胞系Hela細胞中p38δ蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；
　　2.與轉染空白對照載體Hela細胞相比，轉染p38δ表達載體Hela細胞凋亡水平顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；
　　3.與對照Hela細胞株相比，穩(wěn)定表達p3

6、8δ Hela細胞株在缺氧條件及順鉑處理條件下細胞凋亡水平顯著提高，差異均有統(tǒng)計學意義（p均<0.05）；
　　4.與對照處理細胞相比，缺氧及順鉑處理后Hela細胞中p38δ第180位蘇氨酸和第182位酪氨酸磷酸化水平顯著提高，差異均有統(tǒng)計學意義（p均<0.05）；
　　5.與轉染野生型p38δ表達載體Hela細胞相比，轉染p38δ激酶失活突變表達載體Hela細胞凋亡水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（p<0.05）；
　

7、　6.與對照Hela細胞株相比，穩(wěn)定表達p38δHela細胞株在缺氧及順鉑處理條件下，凋亡調(diào)控因子Bax和p53蛋白表達量顯著上調(diào)，而Bcl-2蛋白表達量顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（p均<0.05）。
　　結論：
　　1.在宮頸癌組織細胞和在宮頸癌Hela細胞中，p38δ的蛋白表達水平降低；
　　2.Hela細胞中高表達p38δ促進細胞凋亡的發(fā)生，并且促進Hela細胞對低氧環(huán)境及順鉑的敏感度；
　　3.低氧環(huán)境