嬰兒雙歧桿菌-hDCN腫瘤靶向性基因治療系統(tǒng)的構建及對K562細胞作用的研究.pdf

1、目的：構建人核心蛋白聚糖（humandecorin，hDCN）原核表達載體PGEX-4T-1-DCN，將重組質粒轉化到嬰兒雙歧桿菌中，待其充分表達后，取培養(yǎng)菌上清液觀察其對K562細胞的增殖、凋亡和細胞周期的作用。
　　 方法：1.采用雙酶切方法擴增并回收DCN基因片段，利用分子重組技術構建PGEX-4T-1-DCN原核表達載體，應用電轉化法將重組質粒轉化至雙歧桿菌，并進行EcoRI、NotI雙酶切及測序鑒定。
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2、.轉化成功后提取上清液，處理K562細胞，于倒置顯微鏡下觀察K562細胞增殖抑制狀況、形態(tài)改變及細胞凋亡情況。
　　 3.10％、20％和30％培養(yǎng)菌上清液作用48h后，采用流式細胞儀檢測K562細胞凋亡情況，并進行細胞周期阻滯分析。
　　 結果：1.構建重組質粒經(jīng)雙酶切鑒定，所擴增基因片斷與目的基因片斷大小相符；測序后與Genbank中DCN基因序列(NT029419)相比對完全相符，沒有發(fā)生突變。
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3、倒置顯微鏡下觀察到DCN目的質粒轉化雙歧桿菌上清液組、空質粒轉化雙歧桿菌上清液組、單純雙歧桿菌上清液組細胞均出現(xiàn)凋亡形態(tài)學改變。其中DCN轉化雙歧桿菌組作用下細胞形態(tài)變化最為明顯，可見細胞形狀不規(guī)整，并有核碎裂、凋亡小體出現(xiàn)，細胞增殖明顯減慢。
　　 3.流式細胞儀檢測可見，單純雙歧桿菌上清液組與轉化空質粒雙歧桿菌上清液組可誘導K562細胞出現(xiàn)凋亡，早期凋亡率分別為11.26±1.54(％)和13.85±1.33(％)，而轉化D

4、CN的雙歧桿菌上清液組細胞凋亡率可達23.79±2.48(％)，與前兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 4.細胞周期分析結果表明，與對照組(5.04±0.78％)相比，G2/M期細胞比例在單純雙歧桿菌上清液組(10.56±0.81％)、空載體雙歧桿菌上清液組(12.98±1.66％)及轉化DCN雙歧桿菌上清液組(13.37±0.74％)明顯增高(P＜0.01)，有統(tǒng)計學意義：單純雙歧桿菌上清液組和空載體雙歧桿菌上清

5、液組G0/G1期分別變現(xiàn)為(65.59±1.54％，63.89±1.24％)，相比較空白組(62.23±0.72％)無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，而DCN轉化雙歧桿菌上清液組G0/G1期為(72.24±0.54％)，與其他三組相比，其差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 結論：1.成功構建了DCN基因原核表達載體PGEX-4T-1-DCN。
　　 2.應用電轉化方法成功將外源性基因hDCN轉化入嬰兒雙歧桿菌中。