肝臟靶向治療載體系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的：
　　 1.通過分子生物學(xué)技術(shù)對腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus,AAV）的改構(gòu)以獲得既能夠特異性結(jié)合乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen, HBsAg）又?jǐn)y帶shRNA的重組病毒，為開發(fā)治療HBV的靶向性試劑和藥物奠定基礎(chǔ)。
　　 2.研究肝臟去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor, ASGPR）大亞基異構(gòu)體的生物學(xué)功能，

2、為進一步以其為靶標(biāo)的肝臟靶向治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.運用重組PCR技術(shù)將本室篩選得到的針對乙肝表面抗原的特異性多肽插入到2型腺相關(guān)病毒（AAV2）核衣殼蛋白的587位氨基酸處，同時將針對HBsAg的shRNA插入到AAV2的基因組。構(gòu)建既攜帶shRNA又靶向HBsAg的重組AAV2病毒。
　　 2.運用磷酸鈣共轉(zhuǎn)染法包裝重組的病毒，病毒經(jīng)過純化后，Real-Time PCR測定滴度。重組病毒按

3、照一定的滴度感染HepG2、HepG2.215細胞，流式細胞儀檢測感染效率。
　　 3.肝素封閉實驗和HBsAb封閉實驗驗證重組病毒感染HepG2.215細胞的特異性，ELISA檢測病毒對HBsAg、HBeAg的抑制。
　　 4.從正常人肝組織中克隆出ASGPR大亞基H1a、H1b和小亞基H2c,構(gòu)建EGFP融合表達質(zhì)粒，熒光顯微鏡下觀察大亞基H1a、H1b和小亞基H2c的細胞定位。
　　 5.建立穩(wěn)定表達

4、ASGPRH1a、ASGPRH2c的功能性細胞系來研究ASGPR大亞基異構(gòu)體H1b在ASGPR分子結(jié)合配體功能中的作用，同時研究Sasgpr的生物學(xué)功能。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建了同時攜帶靶向HBsAg多肽和攜帶shRNA的重組AAV2，命名為rAAVssyU6-shRNA-hrGFP。純化的病毒滴度在109v.g/ml以上。
　　 2.rAAVssyU6-shRNA-hrGFP對HepG2、Hep

5、G2.215細胞的感染率較AAV2明顯升高，并且對HepG2.215細胞最為明顯。并且可以抑制HepG2.215細胞HBsAg、HBeAg的表達。
　　 3.肝素封閉實驗可以促進rAAVssyU6-shRNA-hrGFP病毒感染HepG2.215細胞，同時HBsAb封閉實驗明顯降低rAAVssyU6-shRNA-hrGFP病毒感染HepG2.215細胞。
　　 4.成功構(gòu)建了EGFP融合表達質(zhì)粒，EGFP-H1a主要

6、在細胞膜表達；EGFP-H1b主要在細胞質(zhì)內(nèi)形成塊狀或顆粒狀的聚集物；EGFP-H2c在細胞膜和細胞質(zhì)內(nèi)均勻分布。
　　 5.成功建立了表達ASGPR分子的功能性細胞系。并且ASGPR大亞基異構(gòu)體H1b不影響ASGPR分子結(jié)合配體分子ASOR，Sasgpr下調(diào)ASGPR分子結(jié)合配體的功能；Sasgpr可以非特異性地和細胞結(jié)合，ASOR可以特異性上調(diào)Sasgpr與細胞的結(jié)合。
　　 結(jié)論：
　　 1.rAAVs

7、syU6-shRNA-hrGFP對HepG2.215細胞的感染率明顯升高，并且可以抑制HepG2.215細胞HBsAg、HBeAg的表達。
　　 2.rAAVssyU6-shRNA-hrGFP同時保留天然的趨向性和對HBsAg的靶向性。
　　 3.單獨的ASGPR大亞基異構(gòu)體H1b不影響ASGPR分子結(jié)合配體分子ASOR。
　　 4.Sasgpr可以和ASOR分子形成復(fù)合物。Sasgpr在維持體內(nèi)糖基配體復(fù)