磁靶向熱敏脂質體為載體的腫瘤診斷體系的研究.pdf

1、臨床上腫瘤的單獨化療常常會導致治療效果不佳，探索多機制治療腫瘤是提高腫瘤治療指數(shù)的有效手段之一。C60具有作為藥物轉運載體和射頻（RF）熱治療（RTT）的潛力，本研究將C60衍生化，使其具有磁靶向能力，并使其作為小分子射頻發(fā)熱劑，包裹在熱敏脂質體內部，通過射頻照射發(fā)熱控制藥物釋放。其主要內容包括：（1）構建診療一體化的多功能脂質體藥物轉運系統(tǒng)；（2）以人源乳腺癌細胞（MCF-7）為模型對其體外抗腫瘤活性進行評價；（3）采用鼠源黑色素瘤B

2、16-F10細胞株，建立C57雌性小鼠荷瘤模型，對其體內抗腫瘤活性評價。
　　為使C60具有磁靶向和腫瘤診斷功能，首先將四氧化三鐵納米粒子（Fe3O4）通過水熱法化學鍵合到 C60的表面，并用 PEG2000進行修飾，以改善 C60-Fe3O4的水溶性和生物相容性，合成的C60-Fe3O4-PEG2000具有超順磁性和射頻敏感性。然后將 C60-Fe3O4-PEG2000和多西他賽（DTX）抗腫瘤藥包裹在具有葉酸靶頭的熱敏脂質體中

3、，形成的載藥系統(tǒng)（DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000）將主動靶向和磁靶向相結合，使腫瘤細胞對藥物有更高的攝取量，提高了腫瘤治療指數(shù)。
　　DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000的制備采用薄膜法，在單因素考察的基礎上，采用正交實驗優(yōu)化處方。將制備的 DPPC/ C60-Fe3O4-PEG2000進行了表征，其平均粒徑為172.2±1.6nm；透射電鏡（TEM）結果顯示，DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000為類

4、球形；差示掃描量熱（DSC）分析結果顯示，熱敏脂質體的相變溫度42℃；采用超濾離心法和HPLC法測定載藥系統(tǒng)中DTX的包封率，結果表明：DTX在脂質體中的包封率達90％；采用透析袋法分別測定了熱敏脂質體在37℃和42℃時DTX的體外釋放，結果表明通過調節(jié)溫度能較好的控制藥物釋放DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000具有強磁性，MRI實驗表明 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX在磁共振共振T2場成像，具有明顯的濃度

5、依賴性和黑化效應。
　　本研究選擇人源乳腺癌細胞（MCF-7）作為其體外抗腫瘤活性評價的模型，考察了DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000的細胞射頻照射毒性及其影響因素，并初步研究了其細胞毒作用機制，包括細胞內攝取實驗、活性氧的測定、細胞周期和細胞凋亡等。采用 SRB法考察了 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000的細胞毒性，結果顯示DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000在射頻照射下顯著增強細胞抑制率，明顯增強細

6、胞毒性；射頻照射時間對細胞毒產生影響，照射20min時的抑制率最大。MCF-7攝取實驗中，與C60-Fe3O4-PEG2000相比，DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000有更多的細胞攝入量，表明連有葉酸靶頭的熱敏脂質體更有利于包裹藥物進入細胞內部；利用熒光探針進行活性氧檢測，結果顯示DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000在13.56MHz射頻照射下，能夠產生大量的活性氧；采用流式細胞儀測定了細胞凋亡和細胞周期，結果顯示，射頻

7、照射下 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX能夠引起更多的腫瘤細胞凋亡，改變原有的細胞周期，影響了細胞的有絲分裂，從而對腫瘤細胞產生殺傷作用。
　　采用鼠源黑色素瘤B16-F10細胞株，建立C57雌性小鼠荷瘤作為其體內抗腫瘤活性評價的模型。DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX的體內抗腫瘤效果評價中，考察了 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX分別在射頻和為射頻條件下對荷瘤小鼠腫瘤的抑

8、制作用，結果表明 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX在葉酸靶向和磁靶向的載體系統(tǒng)雙重作用下藥物更易于滯留在腫瘤部位，13.56MHz射頻照射后產生熱量，使藥物和 C60-Fe3O4-PEG2000從熱敏脂質體中釋放出來，實現(xiàn)多機制殺傷腫瘤細胞的效果。DTX在小鼠血漿的藥代動力學實驗結果表明， DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX明顯延長了DTX在血液中的循環(huán)時間。藥物在各組織中的分布結果顯示，具有磁靶向

9、的 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX使藥物更多的聚集在腫瘤部位，該結果也進一步證明構建的納米給藥射頻熱療體系在體內的磁靶向作用。此外，MRI結果顯示注射DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX后，在外加磁場作用下，小鼠腫瘤部位觀察到明顯的黑化現(xiàn)象，提示DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX可作為體內磁共振成像T2場的造影劑。
　　體外抗腫瘤活性實驗表明：DPPC/C60-Fe3O4-P

10、EG2000/DTX可有效的靶向MCF-7細胞，并高效的穿透細胞膜，攜帶更多的DTX進入細胞內部，射頻照射DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX能高效的產生 ROS，發(fā)揮更強的射頻熱療作用，釋放出藥物和C60-Fe3O4-PEG2000，從而誘導MCF-7細胞凋亡，最終抑制MCF-7細胞的生長和增殖。體內的抗腫瘤活性實驗表明：DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX具有較低的系統(tǒng)毒性，并延長DTX在體內的循環(huán)時

11、間，當腫瘤部位外加磁場時，能將更多的DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX納米粒子滯留在腫瘤部位，射頻照射， C60發(fā)揮其熱療作用，從而控制藥物釋放，通過 C60射頻照射產生活性氧、腫瘤熱損傷和DTX抗腫瘤藥物多機制誘導腫瘤細胞的凋亡，最終抑制腫瘤的生長。另外，注射 DPPC/C60-Fe3O4-PEG2000/DTX納米粒子后，使腫瘤部位在磁共振成像中T2場信號強度大幅度下降，可以將其用作腫瘤磁共振成像診斷的對比劑。