GE11肽介導(dǎo)的靶向脂質(zhì)體抗腫瘤作用及攝取機(jī)制的研究.pdf

1、目的：本文以A549細(xì)胞表面過度表達(dá)的EGFR為靶點(diǎn)，旨在制備新型多肽GE11修飾的阿霉素脂質(zhì)體，考察GE11修飾脂質(zhì)體的體外靶向效率、細(xì)胞毒性、攝取能力，對GE11修飾脂質(zhì)體在腫瘤部位不同時(shí)間的分布進(jìn)行體內(nèi)評價(jià)，并研究GE11修飾脂質(zhì)體的攝取機(jī)制，為非小細(xì)胞肺癌的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：本研究通過加成反應(yīng)合成DSPE-PEG2000-GE11，通過核磁共振氫譜（1H-NMR）和紅外光譜（FITR）驗(yàn)證產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，采用高效

2、液相色譜（HPLC）分析GE11與DSPE-PEG2000-Mal的連接率。利用薄膜分散-后插入法制備GE11修飾阿霉素脂質(zhì)體（GE11-LP/DOX），并應(yīng)用DLS、TEM和HPLC對脂質(zhì)體的粒徑、電位、形貌和包封率進(jìn)行表征。通過MTT實(shí)驗(yàn)篩選脂質(zhì)體表面連接GE11的最佳密度和測定脂質(zhì)體的IC50值，采用熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀對脂質(zhì)體的攝取分別進(jìn)行定性和定量考察。采用近紅外活體成像儀動態(tài)觀察脂質(zhì)體在腫瘤組織的聚集過程。通過流式細(xì)胞儀和

3、共聚焦顯微鏡分別考察脂質(zhì)體的內(nèi)吞機(jī)制和細(xì)胞內(nèi)定位。
　　結(jié)果：1H-NMR和FTIR結(jié)果證實(shí)合成了DSPE-PEG2000-GE11，GE11與DSPE-PEG2000-Mal的連接率為90%。制備的不同GE11密度修飾的脂質(zhì)體粒徑在124nm左右，zeta電位在-10mv左右，TEM觀察脂質(zhì)體為類圓形囊泡，阿霉素的包封率大約為92%。靶頭密度篩選表明脂質(zhì)體表面的GE11密度與靶向效率有關(guān)，10%GE11修飾脂質(zhì)體對A549細(xì)胞的

4、靶向效率最高。GE11-LP/DOX的IC50值（1.29μg/mL）比對照組PEG-LP/DOX的IC50值（3.35μg/mL）低2.6倍。細(xì)胞攝取結(jié)果表明，在相同時(shí)間內(nèi)，與PEG-LP/DOX相比GE11-LP/DOX更容易被攝取進(jìn)入細(xì)胞。在一定時(shí)間內(nèi)，兩種脂質(zhì)體逐漸向腫瘤組織聚集，而GE11-LP/DOX在腫瘤組織的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于PEG-LP/DOX組。低溫和能量耗竭降低了細(xì)胞對PEG-LP/DOX和GE11-LP/DOX的攝

5、取，抑制劑氯丙嗪和秋水仙素對兩種脂質(zhì)體的攝取有抑制作用，共聚焦顯微鏡觀察GE11-LP/DOX內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞后與溶酶體融合。
　　結(jié)論：本研究合成了DSPE-PEG2000-GE11，通過后插入法制備了GE11-LP/DOX。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明脂質(zhì)體表面連接的GE11與EGFR識別并結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞對脂質(zhì)體的攝取，增強(qiáng)了脂質(zhì)體對細(xì)胞的毒性；活體熒光成像實(shí)驗(yàn)表明GE11-LP/DOX聚集在裸鼠的腫瘤部位，并且主動靶向腫瘤組織。細(xì)胞攝取GE