米托蒽醌葉酸靶向脂質體的研究.pdf

1、脂質體可以提高藥物的穩(wěn)定性，降低毒副作用，并可以通過增強滲透與滯留（Enhanced Permeation and Retention，EPR）效應使裝載抗腫瘤藥物的脂質體在腫瘤組織富集以提高藥物在腫瘤組織的被動靶向性。當脂質體進入腫瘤組織后將包裹的藥物釋放到腫瘤間質，以游離藥的形式進入到腫瘤區(qū)細胞中，這一過程相對比較緩慢，并且不能有效的進入到多藥耐藥的腫瘤細胞內。構建葉酸（Folic Acid，F(xiàn)A）修飾的聚乙二醇（PEG）化磷脂主動

2、靶向脂質體，可以改變脂質體的向腫瘤細胞遞送藥物的方式。由于，腫瘤細胞表面高表達的葉酸受體，進入腫瘤區(qū)的表面修飾葉酸的脂質體可以與其特異性結合，將完整的脂質體內吞進入腫瘤細胞，之后，富集到細胞內的脂質體再釋放出游離藥殺傷腫瘤細胞。
　　目的：
　　本研究制備葉酸靶向脂質體，通過改變藥物的遞送途徑，增加藥物在腫瘤細胞內的富集并實現(xiàn)有效釋放，從而提高藥物的治療指數(shù)。同時，進行克服腫瘤細胞多藥耐藥性的研究，為腫瘤多藥耐藥治療提供依據(jù)

3、。
　　方法：
　　采用Western Blot檢測細胞內葉酸受體蛋白的表達，采用實時熒光定量PCR的方法檢測葉酸受體基因mRNA的表達，從而篩選出高表達葉酸受體的腫瘤細胞用于后續(xù)試驗。
　　確定葉酸靶向脂質體的制備方法：首先制備以硫酸銨溶液為內相的空白脂質體，通過葡聚糖凝膠Sephadex G-75柱透析置換空白脂質體外相，形成硫酸銨梯度，將藥物與透析后的空白脂質體孵育一定時間即得脂質體混懸液。
　　進行葉酸靶

4、向脂質體的細胞攝取試驗，以阿霉素為藥物，設計三因素三水平試驗，考察不同 DSPE-mPEG2000含量、葉酸輔料類型、葉酸輔料含量、脂質體粒度等因素對腫瘤細胞攝取率的影響，從而篩選出優(yōu)化的處方。
　　以優(yōu)化的處方制備米托蒽醌葉酸靶向脂質體，進行制劑學性質研究，主要包括外觀、pH值、粒度、滲透壓、包封率、含量和釋放率等指標的測定，并進行2個月的穩(wěn)定性試驗。
　　采用MCF-7人乳腺癌細胞和MCF-7/ADR耐藥細胞對米托蒽醌游

5、離藥、米托蒽醌無葉酸脂質體（MIT-L）、米托蒽醌葉酸靶向脂質體（MIT-FL）進行細胞攝取試驗及細胞抑制（MTT）試驗，考察葉酸靶向脂質體克服多藥耐藥性情況。
　　進行高表達和低表達葉酸α受體的腫瘤細胞和表達葉酸β受體的腫瘤細胞的細胞攝取實驗及細胞抑制實驗，以考察葉酸靶向脂質體在葉酸表達程度不同的細胞中的富集量差異，以及進入細胞的脂質體能否有效的起到殺傷腫瘤細胞的作用。
　　以NOD-SCID雌性小鼠為實驗動物，建立人 K

6、B口腔表皮樣癌移植瘤腫瘤模型，進行米托蒽醌葉酸靶向脂質體的藥效學研究，考察小鼠的存活、體重變化和腫瘤變化情況，以腫瘤體積抑制率來評價藥物治療效果，以小鼠體重的降低來評價藥物的毒性。
　　結果：
　　從蛋白水平和mRNA水平分別篩選出了高表達和低表達葉酸α受體的腫瘤細胞，表達量順序如下：KB>BEL-7402>SPC-A-1>SMMC-7721>MCF-7,和表達葉酸β受體的腫瘤細胞人髓性白血病 MV4-11和小鼠淋巴瘤白血病

7、 L1210，且蛋白質和mRNA水平的檢測結果基本一致。
　　硫酸銨梯度法制備的葉酸靶向脂質體包封率高達99％以上，重現(xiàn)性良好。優(yōu)化的處方為A以占HSPC的摩爾比計，DSPE-mPEG2000為2.6%、DSPE-PEG3350-FA為0.4%、粒度為90 nm；B DSPE-mPEG2000為2.6%、CHOL-PEG3350-FA為0.4%、粒度為70 nm。
　　質量研究結果顯示：兩個處方六批米托蒽醌葉酸靶向脂質體的p

8、H值、滲透壓、粒徑、包封率均符合要求，8小時體外釋放率分別為0.69%、9.30%。穩(wěn)定性結果顯示：脂質體混懸液在2-8℃條件下存放2個月，上述各指標均無明顯變化。
　　對比米托蒽醌游離藥和MIT-L進入MCF-7細胞和MCF-7/ADR耐藥細胞的藥物攝取發(fā)現(xiàn)，MCF-7細胞攝取量明顯多于MCF-7/ADR細胞，表明MCF-7/ADR細胞對游離米托蒽醌產(chǎn)生耐藥性；而對于MIT-FL，MCF-7細胞攝取量少于MCF-7/ADR細胞，

9、連有葉酸的脂質體與葉酸受體結合內吞進入細胞，藥物進入細胞的多少與細胞表面葉酸受體的表達有關，MTT實驗結果顯示，藥物以脂質體形式進入細胞后，MIT-FL和MIT-L均可抑制MCF-7和MCF-7/ADR細胞的生長，對于MCF-7細胞，相同濃度下MIT-FL與MIT-L抑制率的差異不大，而在耐藥細胞MCF-7/ADR中，相同濃度下MIT-FL的抑制率明顯高于MIT-L。表明以葉酸為靶向機制通過內吞進入細胞的脂質體可以克服腫瘤細胞的多藥耐藥

10、性。
　　細胞攝取實驗結果表明，對于葉酸受體高表達的細胞，葉酸靶向脂質體相對于無葉酸脂質體，攝取率高，靶向性強，對于葉酸受體相對低表達的細胞，兩脂質體靶向性差異不明顯。此外，靶向脂質體進入葉酸受體相對高表達的細胞的攝取率明顯高于葉酸受體相對低表達的細胞，表明當脂質體表面修飾了葉酸配體后，可提高靶向到葉酸受體高表達腫瘤細胞的能力。MTT實驗顯示，大單室兩個脂質體處方對細胞均無抑制作用，米托蒽醌葉酸靶向小單室脂質體（MIT-FSL）對

11、細胞有顯著的抑制作用，經(jīng)計算其IC50值為3644.3 ng/mL，米托蒽醌無葉酸小單室脂質體（MIT-SL）也有抑制作用，其IC50值為32583.8ng/mL。故MIT-FSL抑制作用大于MIT-SL，小單室脂質體修飾葉酸后能夠增加向高表達葉酸受體細胞內的遞送，且能夠在細胞內有效釋放，達到殺傷細胞的作用。
　　小鼠接種人KB口腔表皮樣癌移植瘤毒性結果顯示，游離藥物組的動物體重下降較脂質體組大，即脂質體的毒性低于游離藥物，說明將

12、米托蒽醌包裹于脂質體中可降低藥物的毒副作用。藥效結果表明，各給藥組對腫瘤的生長均有抑制作用，但脂質體組對腫瘤的抑制作用弱于游離藥組，推其原因為脂質體相較于游離藥在腫瘤部位的灌注不良，即一定時間內進入腫瘤區(qū)的藥物濃度低于游離藥。另外，脂質體的釋放率可能也是導致藥效不能發(fā)揮的原因。
　　結論：
　　將葉酸修飾于脂質體表面，制備得到的葉酸靶向脂質體，包封率高，重現(xiàn)性好。其具有兩大優(yōu)勢，一為可有效增加進入腫瘤耐藥細胞的藥物含量，克服