葉酸受體靶向熊果酸長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的制備及其抑瘤作用的研究.pdf

1、研究目的：熊果酸（Urosolic acid，UA）具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)和良好的抗癌效果，但因其水溶性差，使其廣泛應(yīng)用受到限制。本研究首先制備熊果酸長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，再利用葉酸與葉酸受體之間的特異性結(jié)合能力和某些腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體過度表達(dá)的特點(diǎn)，用葉酸修飾的脂質(zhì)材料制備葉酸靶向熊果酸脂質(zhì)體，極大地提高了熊果酸脂質(zhì)體在腫瘤部位的富集，在解決熊果酸溶解性問題的同時(shí)，增加腫瘤靶區(qū)組織里的藥物濃度，延長(zhǎng)其作用時(shí)間，提高抗癌效果，降低藥物的毒副作用

2、，為臨床腫瘤的有效治療提供一種新的思路和方法。
　　研究方法：在本課題的研究中，首先采用經(jīng)典的脂質(zhì)體制備方法薄膜分散法分別制備非靶向熊果酸長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體（non-targeted PEGylated liposomal UA，PL-UA）和葉酸受體靶向熊果酸長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體（folate-receptor targeted liposomal UA，F(xiàn)TL-UA），同時(shí)考察熊果酸脂質(zhì)體的理化性質(zhì)如粒徑、載藥量、包封率、電位和穩(wěn)定性等各項(xiàng)

3、因素。
　　選擇合適的腫瘤靶向細(xì)胞，探討熊果酸脂質(zhì)體的細(xì)胞靶向性及體外抑瘤作用，分析PL-UA和FTL-UA對(duì)人口腔表皮樣癌（KB）細(xì)胞抑制作用上的差異性：利用細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)（MTT）分析熊果酸脂質(zhì)體對(duì)KB腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用；Hoechst33258熒光染色分析細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞術(shù)分析熊果酸脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響和細(xì)胞周期分布的變化；通過Annexin V-FITC/PI雙染的細(xì)胞凋亡試驗(yàn)，定量分析藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋

4、亡的具體情況。
　　考察UA脂質(zhì)體在小鼠體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)及組織分布的特征：通過對(duì)小鼠血漿、心、肝、脾、胃、腎等組織的藥物含量進(jìn)行分析，考察熊果酸隱形納米脂質(zhì)體、游離藥物在體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)作用、組織分布上的差異性，為進(jìn)一步研究葉酸受體靶向脂質(zhì)體在腫瘤治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。
　　考察熊果酸脂質(zhì)體葉酸靶向治療荷瘤鼠人口腔表皮樣癌的作用：在前述實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步證實(shí)FTL-UA是否具有良好的抗腫瘤效果，利用KB細(xì)胞表面大量表達(dá)葉酸受

5、體的特征，以balb/c裸鼠為研究對(duì)象，建立荷瘤鼠人口腔表皮樣癌KB腫瘤模型，通過對(duì)該模型尾靜脈注射FTL-UA，觀察其靶向治療荷瘤鼠人口腔表皮樣癌的效果及對(duì)荷瘤鼠生存周期的影響，為FTL-UA進(jìn)一步應(yīng)用于臨床腫瘤靶向治療提供依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：采用薄膜分散法制備的FTL-UA及PL-UA的平均粒徑分別為(160.1±12.5)nm，(151.4±16.1)nm；分散系數(shù)為0.196±0.052，0.168±0.066，粒度分布

6、窄，大小均勻；其電位分別為(-21.24±4.2)mV，(-23.15±6.7)mV；包封率為(88.9±7.9)％，(86.7±12.1)％。在4℃放置3個(gè)月后，能維持較好的穩(wěn)定性。
　　在體外，MTT結(jié)果顯示FTL-UA對(duì)KB細(xì)胞有明顯的殺傷作用，其抑制率呈明顯時(shí)間-劑量依賴性，F(xiàn)TL-UA組的IC50值低于PL-UA組（作用72h后的IC50值分別為22.05μM和146.3μM）；細(xì)胞周期分布的結(jié)果顯示FTL-UA主要使K

7、B細(xì)胞阻滯于S期，即腫瘤細(xì)胞的DNA合成期；另外，熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)分析也證實(shí)了FTL-UA能誘導(dǎo)KB細(xì)胞凋亡。
　　給6周齡左右小鼠尾靜脈注射20mg/Kg藥物，通過藥物代謝動(dòng)力學(xué)各參數(shù)和組織分布的分析，熊果酸脂質(zhì)體的半衰期、藥-時(shí)曲線下面積、表觀分布容積、平均滯留時(shí)間和清除率較單純給予游離熊果酸有顯著性差異，表現(xiàn)出明顯的體內(nèi)緩釋和長(zhǎng)循環(huán)效應(yīng)。同時(shí)，熊果酸脂質(zhì)體在肝、腎中含量高于其他組織，在其他組織中分布很少，僅有少量組織殘留

8、。
　　建立balb/c裸鼠KB腫瘤模型，尾靜脈分別注射4.5mg/Kg的游離UA、PL-UA及FTL-UA，每隔一天注射一次，連續(xù)給藥5次。其結(jié)果顯示FTL-UA組中每只荷瘤鼠的腫瘤表面有明顯的壞死空洞形成，瘤體逐漸萎縮，明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，生存周期也高于其他組。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，F(xiàn)TL-UA有望作為新型的化療藥物在人口腔癌化療方面發(fā)揮積極的作用。除了改善熊果酸的溶解性外，還可增加藥物療效，延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)時(shí)間