人工設(shè)計(jì)的CXCR4靶向肽應(yīng)用于AML治療的基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的:美國最新癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，白血病尤其是急性髓系白血病(AML)每年的發(fā)病率和死亡率依然很高，患者很難達(dá)到完全緩解和長期無病生存，其主要原因是白血病細(xì)胞在體內(nèi)的浸潤、耐藥、微量殘留和復(fù)發(fā)。大量研究顯示，骨髓內(nèi)的基質(zhì)細(xì)胞通過大量分泌基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（CXCL12，亦稱為SDF-1）激活白血病細(xì)胞表面高表達(dá)的特異性受體CXCR4，介導(dǎo)白血病細(xì)胞向其遷移、粘附并獲取促增殖、抗凋亡、耐藥信號，從而形成保護(hù)微環(huán)境，導(dǎo)致患者化療后的白血病細(xì)胞

2、微量殘留，為其之后的復(fù)發(fā)埋下隱患。因此，拈抗CXCR4/CXCL12生物軸對于白血病治愈具有重要意義。考慮到人工設(shè)計(jì)的小分子多肽具有免疫原性低、成本低廉、設(shè)計(jì)靈活性高等優(yōu)越性，本研究根據(jù)CXCR4受體序列特征設(shè)計(jì)多肽，篩選出能有效抑制CXCR4/CXCL12生物軸介導(dǎo)的AML細(xì)胞遷移、粘附的拮抗多肽，并將其與多種化療藥物聯(lián)合使用，在體外（細(xì)胞水平）、體內(nèi)（AML小鼠異種移植模型水平）評價(jià)其治療效果和研究其作用機(jī)理。利用健康小鼠評價(jià)多肽的

3、體內(nèi)安全性。
　　方法:以人AML細(xì)胞系HL-60、NB4、THP-1、U937及小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞MS-5、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ea.hy926為模型，通過流式細(xì)胞術(shù)分析多肽與白血病細(xì)胞的結(jié)合力;利用流式細(xì)胞術(shù)和western blot檢測Annexin V-PI的結(jié)合和caspase-3的激活，評價(jià)多肽對AML細(xì)胞和非惡性細(xì)胞MS-5、ea.hy926凋亡的影響;利用transwell細(xì)胞遷移小室以及細(xì)胞共培養(yǎng)方法研究該多肽對CXC

4、R4/CXCL12軸介導(dǎo)的AML細(xì)胞遷移、粘附的作用;并利用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架微絲蛋白重排，western blot檢測CXCR4下游Akt、Erk、p38信號通路的變化，探討多肽可能的分子作用機(jī)制。利用Annexin V-PI雙染法和臺盼藍(lán)染色法檢測多肽聯(lián)合化療藥（長春新堿、順鉑、十羥基喜樹堿）對與骨髓基質(zhì)細(xì)胞MS-5共培養(yǎng)的AML細(xì)胞凋亡和活力的影響。建立AML小鼠異種移植模型，分別于皮下注射多肽前后通過尾靜脈采集外周血，

5、利用CD33標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)研究多肽對AML細(xì)胞的動員效果。將多肽與化療藥（長春新堿和環(huán)磷酰胺）聯(lián)用對AML小鼠進(jìn)行治療，統(tǒng)計(jì)小鼠生存期，并利用流式細(xì)胞術(shù)和組織切片觀察評價(jià)小鼠骨髓、脾臟、外周血中的AML細(xì)胞負(fù)荷以及脾臟、肝臟內(nèi)AML細(xì)胞的浸潤情況。對健康BALB/c小鼠皮下注射多肽，通過觀察組織切片和檢測肝、腎功主要血生化指標(biāo)評價(jià)多肽的體內(nèi)安全性。
　　結(jié)果:(1)篩選出的多肽（命名為E5）與四株AML細(xì)胞均有較迅速而穩(wěn)定的結(jié)合

6、;(2) E5有效抑制CXCL12及分泌CXCL12的骨髓基質(zhì)細(xì)胞MS-5誘導(dǎo)的AML細(xì)胞定向遷移，并顯著減少AML細(xì)胞與MS-5之間的粘附，隨著E5濃度存0.1～10μM范圍內(nèi)逐漸提高抑制效果增強(qiáng)，E5對AML細(xì)胞遷移、粘附的抑制具有濃度依賴性;(3)濃度高于20μM時(shí)，E5直接誘導(dǎo)AML細(xì)胞凋亡，但對非惡性細(xì)胞（MS-5和ea.hy926）的活力沒有顯著影響;(4) E5干擾了CXCL12誘導(dǎo)的AML細(xì)胞微絲骨架定向聚集，使微絲分布

7、彌散，并抑制了CXCL12誘導(dǎo)的CXCR4下游Akt、Erk、p38三種蛋白的磷酸化，拮抗了CXCR4/CXCL12軸介導(dǎo)的信號通路;(5) E5與化療藥長春新堿、順鉑、十羥基喜樹堿聯(lián)合使用，48 h后顯著提高了化療藥誘導(dǎo)的AML細(xì)胞凋亡率，10天內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的AML細(xì)胞活力持續(xù)地降低，E5顯著逆轉(zhuǎn)了MS-5介導(dǎo)的AML細(xì)胞耐藥性;(6)皮下注射E54h后，AML小鼠外周血中AML細(xì)胞比例提升約1.84倍，E5動員了滯留在骨髓

8、微環(huán)境中的AML細(xì)胞進(jìn)入外周血;(7)將E5與環(huán)磷酰胺、長春新堿聯(lián)合治療AML小鼠，與單用化療藥組相比，聯(lián)合用藥組小鼠骨髓、脾臟、外周血中AML細(xì)胞比例顯著降低，脾腫大現(xiàn)象得到緩解，AML細(xì)胞對脾臟、肝臟的侵襲、浸潤顯著減少，小鼠的生存期也得到延長，E5顯著提高了兩種常規(guī)化療藥的藥效;(8)對健康BALB/c小鼠隔天皮下注射高劑量E5多肽，30天后E5沒有引起小鼠各器官壞死、炎癥等異常病理性改變，組織形態(tài)完整，各器官重量沒有顯著變化，并