核酸識(shí)體應(yīng)用于乳腺癌靶向治療的研究.pdf

1、背景:
　　乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，2008年全球新發(fā)病例約138萬(wàn)，占所有女性新增癌癥病例的23％，導(dǎo)致458503位患者死于乳腺癌，是威脅女性健康的頭號(hào)敵人。在乳腺癌的治療中，阿霉素是首選的一線藥物，阿霉素作用于DNA化學(xué)結(jié)構(gòu)，其作用機(jī)理主要是嵌入DNA而抑制核核酸的合成，對(duì)機(jī)體可產(chǎn)生廣泛的生物化學(xué)效應(yīng)，具有強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性作用。阿霉素副作用有惡心、嘔吐胃腸道反應(yīng)，骨髓抑制造成外周血白細(xì)胞數(shù)量減少，脫發(fā)，等等眾多常見化

2、療副作用，最嚴(yán)重的副作用是該藥物具有心臟毒性，嚴(yán)重時(shí)可以起化療患者心力衰竭，導(dǎo)致死亡。如何降低阿霉素的毒副作用，增強(qiáng)患者對(duì)藥物副作用的耐受，是目前相關(guān)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。核酸識(shí)體(aptamers)，又可稱為化學(xué)抗體，與抗體類似，是具備識(shí)別功能的單、短鏈核糖核酸。篩選核酸識(shí)體的技術(shù)通常稱為配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)，

3、這項(xiàng)技術(shù)的大體流程是將一1013-1016的ssDNA或ssRNA隨機(jī)文庫(kù)與靶向物共同孵育，經(jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增特定與靶向物結(jié)合的序列，通過(guò)數(shù)輪的篩選得到與靶向物特異結(jié)合的核酸識(shí)體。這些核酸識(shí)體的靶向物可以是小的有機(jī)分子、金屬離子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至是組織。通過(guò)折疊形成特殊的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)，核酸識(shí)體能像抗體那樣高效地、專一地識(shí)別靶向物。與天然形成的抗體相比較，人工生成的核酸識(shí)體有以下幾大優(yōu)勢(shì)。這包括快速及高效合成、容易修飾、較高的穩(wěn)定性、低毒

4、性、不會(huì)導(dǎo)致免疫反應(yīng)、高組織通透性以及為實(shí)現(xiàn)不同的診斷治療目的可進(jìn)行特殊的修飾。
　　本實(shí)驗(yàn)擬檢測(cè)從乳腺癌細(xì)胞篩選中得到的核酸識(shí)體與靶細(xì)胞的結(jié)合能力，挑選出其中結(jié)合能力出眾的核酸識(shí)體，研究核酸識(shí)體是否能特異被靶細(xì)胞內(nèi)吞，證實(shí)其是否具備進(jìn)一步研發(fā)成藥物載體的可能，進(jìn)而通過(guò)簡(jiǎn)單的化學(xué)修飾，使之成為阿霉素藥物載體，判斷其是否可應(yīng)用于乳腺癌的靶向治療。
　　方法和結(jié)果:
　　首先檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞篩選結(jié)束后，經(jīng)測(cè)序得到的核酸識(shí)體與

5、靶細(xì)胞、陰性對(duì)照細(xì)胞的結(jié)合能力。證實(shí)其中一條核酸識(shí)體，KMF2-1a，具備良好的特異識(shí)別靶細(xì)胞的能力，結(jié)合穩(wěn)定，不受溫度及時(shí)間的影響。在進(jìn)一步的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)該核酸識(shí)體能特異與雌激素受體、孕激素受體及HER-2表達(dá)陰性的乳腺癌細(xì)胞系(MCF-10AT1，MDA-MB-231)結(jié)合，KMF2-1a有望成為特異識(shí)別三陰性乳腺癌的核酸識(shí)體。
　　其次，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)技術(shù)及激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)核酸識(shí)體KMF2-1a是否能被靶

6、細(xì)胞MCF-10AT1特異內(nèi)吞。首先通過(guò)胰蛋白酶處理細(xì)胞，證實(shí)其可以消除KMF2-1a與細(xì)胞結(jié)合后的熒光信號(hào)。利用此現(xiàn)象，將KMF2-1a與細(xì)胞在37℃下孵育，通過(guò)胰蛋白酶處理后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，仍得到熒光信號(hào)，證實(shí)KMF2-1a被靶細(xì)胞內(nèi)吞。并通過(guò)共聚焦成像進(jìn)一步證實(shí)了此結(jié)論，且KMF2-1a定位于內(nèi)吞體細(xì)胞器。
　　最后，利用阿霉素嵌入至GC堿基互補(bǔ)對(duì)的原理，將KMF2-1a的一端添加GC堿基互補(bǔ)對(duì)，作為藥物載體。經(jīng)MTS實(shí)驗(yàn)