hMAM在乳腺癌診斷、預(yù)后及靶向治療中的應(yīng)用研究及臨床意義.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開論述：
　　第一部分 hMAM在乳腺癌腫瘤組織中的表達(dá)及臨床意義
　　目的：
　　分析hMAM蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，探討乳腺癌組織中hMAM蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性，明確hMAM作為乳腺癌特異性診斷及預(yù)后分子標(biāo)志物的可行性。
　　方法：
　　回顧性分析檢測安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院2012年1月至2014年12月期間確診的乳腺疾病患者組織樣本，包括乳腺原發(fā)性浸潤性癌、

2、乳腺原位癌及乳腺良性病變。乳腺浸潤性癌及部分乳腺原位癌患者行根治性或改良根治性切除術(shù)，部分乳腺原位癌及乳腺良性病變患者行局部手術(shù)。所有患者術(shù)前均未接受任何治療。同時(shí)選取非乳腺來源惡性腫瘤組織以及正常組織作為對照。免疫組織化學(xué)染色檢測乳腺浸潤性癌組織中hMAM及GCDFP-15表達(dá)情況，并分析hMAM蛋白表達(dá)與GCDFP-15表達(dá)及臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系;免疫組織化學(xué)染色檢測乳腺原位癌及良性病變組織中hMAM表達(dá)情況，并檢測非乳腺來源惡性腫

3、瘤及正常組織中hMAM表達(dá)情況。組間陽性率比較及陽性率與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析均采用Pearson's卡方檢驗(yàn)方法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1 hMAM蛋白在乳腺浸潤性癌組織中有兩種表達(dá)模式，一種定位于腫瘤細(xì)胞漿(50/58)，另一種為定位于腫瘤細(xì)胞膜(8/58)。
　　2.hMAM蛋白在良性乳腺疾病中的表達(dá)率為3.77％(2/53)，在乳腺原位癌中的表達(dá)率為20.51％(8/39),而

4、在乳腺浸潤性癌中的表達(dá)率為72.50％(58/80)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，hMAM蛋白表達(dá)在良性乳腺疾病與乳腺原位癌之間、良性乳腺疾病與乳腺浸潤性癌之間以及乳腺原位癌與乳腺浸潤性癌之間均存在顯著性差異(P＜0.01)。
　　3.hMAM蛋白在121例非乳腺腫瘤組織中均不表達(dá)，包括63例消化系統(tǒng)腫瘤、7例呼吸系統(tǒng)腫瘤、32例泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤及19例其它系統(tǒng)腫瘤。
　　4 hMAM蛋白在4例人正常乳腺組織中均低表達(dá)，而在其余36例人

5、正常組織中均不表達(dá)。
　　5.hMAM蛋白在乳腺浸潤性癌組織學(xué)分級Ⅰ級、Ⅱ級及Ⅲ級中的表達(dá)率分別為79.2％、63.6％、78.3％，其表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級無相關(guān)性（P=0.33）。hMAM蛋白表達(dá)率在臨床Ⅰ期乳腺浸潤性癌中為55.6％(5/9)，Ⅱ期為66.0％(33/50)，Ⅲ期為95.2％(20/21)，其表達(dá)與腫瘤臨床分期相關(guān)（P=0.02）;hMAM蛋白表達(dá)率在腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為92.5％(37/40)，在腋窩淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)

6、移組為52.5％(21/40)，其表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.01）;hMAM蛋白表達(dá)與GCDFP-15的表達(dá)具有相關(guān)性(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.hMAM在乳腺癌腫瘤組織中特異性高表達(dá)。
　　2.hMAM表達(dá)與乳腺癌標(biāo)志物GCDFP-15表達(dá)具有相關(guān)性，因此可作為乳腺癌又一特異性分子標(biāo)志物。
　　3.hMAM表達(dá)與腫瘤臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，因此可作為乳腺癌預(yù)后評估分子標(biāo)志物。
　　4

7、.hMAM具有乳腺癌細(xì)胞膜表面表達(dá)模式，因此可作為乳腺癌靶向治療分子標(biāo)志物。
　　第二部分 hMAM mRNA在乳腺癌患者外周血中的表達(dá)及臨床意義
　　目的：
　　建立以hMAM作為分子標(biāo)志物的乳腺癌患者外周血CTC檢測方法，證實(shí)hMAM mRNA在乳腺癌患者外周血中表達(dá)的特異性，并探討外周血hMAM表達(dá)與乳腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性，為hMAM mRNA檢測的臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　研究對

8、象為安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院2012年1月至2014年12月期間入院確.診的80例乳腺原發(fā)性浸潤性癌、39例乳腺原位癌及53例乳腺良性病變患者。75例乳腺原發(fā)性浸潤性癌患者經(jīng)術(shù)前胸片、肝臟B超、頭顱MRI及全身骨掃描等檢查均證實(shí)未見遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。對照組為53例乳腺良性病變。所有患者采集血液前均已經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)病變性質(zhì)，但尚未進(jìn)行手術(shù)切除治療或化療。每例患者均按照要求采集外周血，并進(jìn)行PBMC分離及總RNA提取。SYBR Green RT-

9、PCR檢測hMAM mRNA表達(dá)，并同步進(jìn)行電泳分析，以GAPDH作為內(nèi)對照，以RT-PCR結(jié)果及電泳結(jié)果綜合判斷hMAM mRNA表達(dá)情況。比較不同乳腺疾病患者外周血中hMAM mRNA表達(dá)水平，并分析乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)（組織學(xué)分級、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）的關(guān)系。采用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間陽性率比較及陽性率與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析均采用Pearson's卡方檢驗(yàn)方法。P＜0.

10、05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1 hMAM RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為105bp，內(nèi)對照GAPDH RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為154bp。每例樣本的GAPDH條帶陽性時(shí)，認(rèn)為檢測結(jié)果可信;樣本目的條帶信號(hào)強(qiáng)度等于或強(qiáng)于GAPDH條帶時(shí)，判定為陽性。hMAM mRNA在良性乳腺疾病患者外周血中的陽性表達(dá)率為0％(0/53)，在乳腺原位癌患者外周血中的陽性表達(dá)率為51.3％(20/39)，而在乳腺浸潤性癌患者外周血

11、中的陽性表達(dá)率為75.0％(60/80)。外周血中hMAM mRNA表達(dá)在良性乳腺疾病與乳腺原位癌之間、良性乳腺疾病與乳腺浸潤性癌之間均存在顯著性差異(P＜0.01)。外周血中hMAM表達(dá)在乳腺原位癌與浸潤性癌之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.10）。
　　2.hMAM mRNA在組織學(xué)分級Ⅰ級、Ⅱ級及Ⅲ級乳腺浸潤性癌患者外周血中的表達(dá)率分別為75.00％、75.76％及73.91％，其表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級無相關(guān)性（P=0.99）。

12、hMAM mRNA在Ⅰ期、Ⅱ期及Ⅲ期乳腺浸潤性癌患者外周血中的表達(dá)率分別為66.67％、68.00％及95.24％，其表達(dá)與腫瘤臨床分期無關(guān)（P=0.28）。hMAM mRNA在腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未轉(zhuǎn)移乳腺浸潤性癌患者外周血中的表達(dá)率分別為95.00％及55.00％，其表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.hMAM mRNA在乳腺浸潤性癌患者外周血中特異性高表達(dá)。
　　2.乳腺浸潤性癌患者外周血

13、中hMAM mRNA表達(dá)與腫瘤腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與腫瘤的組織學(xué)分級及臨床分期無關(guān)。
　　3.乳腺癌患者外周血hMAM mRNA SYBR Green RT-PCR檢測可以代替CTC檢測用于監(jiān)測腫瘤轉(zhuǎn)移及評估預(yù)后。
　　第三部分 膜相關(guān)型hMAM的鑒定及對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響
　　目的:
　　明確膜相關(guān)型hMAM蛋白的存在，初步探討膜相關(guān)型hMAM蛋白對乳腺癌細(xì)胞ZR75-1體外增殖的影響。
　　方法:<

14、br>　　免疫組織化學(xué)染色在體內(nèi)組織水平證實(shí)hMAM蛋白的乳腺癌細(xì)胞特異性細(xì)胞膜表達(dá)方式;Western Blot在體外細(xì)胞水平證實(shí)hMAM乳腺癌細(xì)胞表面表達(dá)模式。以抗人hMAM抗體處理乳腺癌細(xì)胞ZR75-1，并設(shè)置無關(guān)抗體對照、陰性對照及空白對照，不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔490nm波長吸光度值，MTT法評價(jià)細(xì)胞增殖活性。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，成組資料間的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

15、意義。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組化染色檢測171例乳腺癌組織中hMAM蛋白的表達(dá)模式。結(jié)果顯示克隆號(hào)為31A5抗體可特異性識(shí)別乳腺組織腫瘤細(xì)胞表面的hMAM蛋白。以31A5抗體作為檢測抗體，免疫組化染色分析結(jié)果顯示在食管癌、肝癌、膽囊癌及結(jié)腸癌組織中31A5抗體標(biāo)記結(jié)果均為陰性;此外，31A5抗體在人胃、肝、肺及腎臟組織中的標(biāo)記結(jié)果也均為陰性。
　　2.以31A5作為檢測抗體，以明確膜表達(dá)的Na+-K+-ATPase

16、作為對照，Western Blot結(jié)果顯示在5株乳腺癌細(xì)胞中，MDA-MB-231細(xì)胞膜蛋白裂解物中hMAM中等強(qiáng)度表達(dá)，而ZR75-1及MDA-MB415細(xì)胞膜蛋白裂解物中hMAM弱表達(dá)。
　　3.以31A5抗體處理乳腺癌細(xì)胞ZR75-1，結(jié)果顯示，與無關(guān)抗體對照、抗體溶媒PBS對照及培養(yǎng)基對照相比，31A5抗體處理乳腺癌細(xì)胞ZR75-1后的第3天，腫瘤細(xì)胞增殖活性降低(P＜0.05);與各對照組相比，其余時(shí)間節(jié)點(diǎn)未顯示細(xì)胞增殖

17、活性的變化。各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)各對照組之間相比，細(xì)胞增殖活性無顯著變化。以MDA-MB-231、MDA-MB415及MCF-7細(xì)胞作為檢測細(xì)胞，與對照組相比，31A5抗體處理后的各時(shí)間節(jié)點(diǎn)細(xì)胞增殖活性無顯著變化。
　　結(jié)論:
　　1.在體內(nèi)乳腺癌組織及體外乳腺癌細(xì)胞中均存在膜相關(guān)型hMAM，不同生物學(xué)特性乳腺癌細(xì)胞中膜相關(guān)型hMAM的表達(dá)水平不同。
　　2.細(xì)胞表面MAM介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能在ZR75-1細(xì)胞增殖中發(fā)揮