hMAM在乳腺癌診斷、預(yù)后及靶向治療中的應(yīng)用研究及臨床意義.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)方面展開(kāi)論述：
　　第一部分 hMAM在乳腺癌腫瘤組織中的表達(dá)及臨床意義
　　目的：
　　分析hMAM蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，探討乳腺癌組織中hMAM蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性，明確hMAM作為乳腺癌特異性診斷及預(yù)后分子標(biāo)志物的可行性。
　　方法：
　　回顧性分析檢測(cè)安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院2012年1月至2014年12月期間確診的乳腺疾病患者組織樣本，包括乳腺原發(fā)性浸潤(rùn)性癌、

2、乳腺原位癌及乳腺良性病變。乳腺浸潤(rùn)性癌及部分乳腺原位癌患者行根治性或改良根治性切除術(shù)，部分乳腺原位癌及乳腺良性病變患者行局部手術(shù)。所有患者術(shù)前均未接受任何治療。同時(shí)選取非乳腺來(lái)源惡性腫瘤組織以及正常組織作為對(duì)照。免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性癌組織中hMAM及GCDFP-15表達(dá)情況，并分析hMAM蛋白表達(dá)與GCDFP-15表達(dá)及臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系;免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)乳腺原位癌及良性病變組織中hMAM表達(dá)情況，并檢測(cè)非乳腺來(lái)源惡性腫

3、瘤及正常組織中hMAM表達(dá)情況。組間陽(yáng)性率比較及陽(yáng)性率與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析均采用Pearson's卡方檢驗(yàn)方法，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1 hMAM蛋白在乳腺浸潤(rùn)性癌組織中有兩種表達(dá)模式，一種定位于腫瘤細(xì)胞漿(50/58)，另一種為定位于腫瘤細(xì)胞膜(8/58)。
　　2.hMAM蛋白在良性乳腺疾病中的表達(dá)率為3.77％(2/53)，在乳腺原位癌中的表達(dá)率為20.51％(8/39),而

4、在乳腺浸潤(rùn)性癌中的表達(dá)率為72.50％(58/80)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，hMAM蛋白表達(dá)在良性乳腺疾病與乳腺原位癌之間、良性乳腺疾病與乳腺浸潤(rùn)性癌之間以及乳腺原位癌與乳腺浸潤(rùn)性癌之間均存在顯著性差異(P＜0.01)。
　　3.hMAM蛋白在121例非乳腺腫瘤組織中均不表達(dá)，包括63例消化系統(tǒng)腫瘤、7例呼吸系統(tǒng)腫瘤、32例泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤及19例其它系統(tǒng)腫瘤。
　　4 hMAM蛋白在4例人正常乳腺組織中均低表達(dá)，而在其余36例人

5、正常組織中均不表達(dá)。
　　5.hMAM蛋白在乳腺浸潤(rùn)性癌組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)及Ⅲ級(jí)中的表達(dá)率分別為79.2％、63.6％、78.3％，其表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級(jí)無(wú)相關(guān)性（P=0.33）。hMAM蛋白表達(dá)率在臨床Ⅰ期乳腺浸潤(rùn)性癌中為55.6％(5/9)，Ⅱ期為66.0％(33/50)，Ⅲ期為95.2％(20/21)，其表達(dá)與腫瘤臨床分期相關(guān)（P=0.02）;hMAM蛋白表達(dá)率在腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組為92.5％(37/40)，在腋窩淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)

6、移組為52.5％(21/40)，其表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.01）;hMAM蛋白表達(dá)與GCDFP-15的表達(dá)具有相關(guān)性(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.hMAM在乳腺癌腫瘤組織中特異性高表達(dá)。
　　2.hMAM表達(dá)與乳腺癌標(biāo)志物GCDFP-15表達(dá)具有相關(guān)性，因此可作為乳腺癌又一特異性分子標(biāo)志物。
　　3.hMAM表達(dá)與腫瘤臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，因此可作為乳腺癌預(yù)后評(píng)估分子標(biāo)志物。
　　4

7、.hMAM具有乳腺癌細(xì)胞膜表面表達(dá)模式，因此可作為乳腺癌靶向治療分子標(biāo)志物。
　　第二部分 hMAM mRNA在乳腺癌患者外周血中的表達(dá)及臨床意義
　　目的：
　　建立以hMAM作為分子標(biāo)志物的乳腺癌患者外周血CTC檢測(cè)方法，證實(shí)hMAM mRNA在乳腺癌患者外周血中表達(dá)的特異性，并探討外周血hMAM表達(dá)與乳腺癌臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性，為hMAM mRNA檢測(cè)的臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　研究對(duì)

8、象為安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院2012年1月至2014年12月期間入院確.診的80例乳腺原發(fā)性浸潤(rùn)性癌、39例乳腺原位癌及53例乳腺良性病變患者。75例乳腺原發(fā)性浸潤(rùn)性癌患者經(jīng)術(shù)前胸片、肝臟B超、頭顱MRI及全身骨掃描等檢查均證實(shí)未見(jiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。對(duì)照組為53例乳腺良性病變。所有患者采集血液前均已經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)病變性質(zhì)，但尚未進(jìn)行手術(shù)切除治療或化療。每例患者均按照要求采集外周血，并進(jìn)行PBMC分離及總RNA提取。SYBR Green RT-

9、PCR檢測(cè)hMAM mRNA表達(dá)，并同步進(jìn)行電泳分析，以GAPDH作為內(nèi)對(duì)照，以RT-PCR結(jié)果及電泳結(jié)果綜合判斷hMAM mRNA表達(dá)情況。比較不同乳腺疾病患者外周血中hMAM mRNA表達(dá)水平，并分析乳腺癌患者外周血中hMAM mRNA表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)（組織學(xué)分級(jí)、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）的關(guān)系。采用SPSS17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間陽(yáng)性率比較及陽(yáng)性率與臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析均采用Pearson's卡方檢驗(yàn)方法。P＜0.

10、05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1 hMAM RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為105bp，內(nèi)對(duì)照GAPDH RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為154bp。每例樣本的GAPDH條帶陽(yáng)性時(shí)，認(rèn)為檢測(cè)結(jié)果可信;樣本目的條帶信號(hào)強(qiáng)度等于或強(qiáng)于GAPDH條帶時(shí)，判定為陽(yáng)性。hMAM mRNA在良性乳腺疾病患者外周血中的陽(yáng)性表達(dá)率為0％(0/53)，在乳腺原位癌患者外周血中的陽(yáng)性表達(dá)率為51.3％(20/39)，而在乳腺浸潤(rùn)性癌患者外周血

11、中的陽(yáng)性表達(dá)率為75.0％(60/80)。外周血中hMAM mRNA表達(dá)在良性乳腺疾病與乳腺原位癌之間、良性乳腺疾病與乳腺浸潤(rùn)性癌之間均存在顯著性差異(P＜0.01)。外周血中hMAM表達(dá)在乳腺原位癌與浸潤(rùn)性癌之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.10）。
　　2.hMAM mRNA在組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)及Ⅲ級(jí)乳腺浸潤(rùn)性癌患者外周血中的表達(dá)率分別為75.00％、75.76％及73.91％，其表達(dá)與腫瘤組織學(xué)分級(jí)無(wú)相關(guān)性（P=0.99）。

12、hMAM mRNA在Ⅰ期、Ⅱ期及Ⅲ期乳腺浸潤(rùn)性癌患者外周血中的表達(dá)率分別為66.67％、68.00％及95.24％，其表達(dá)與腫瘤臨床分期無(wú)關(guān)（P=0.28）。hMAM mRNA在腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未轉(zhuǎn)移乳腺浸潤(rùn)性癌患者外周血中的表達(dá)率分別為95.00％及55.00％，其表達(dá)與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.hMAM mRNA在乳腺浸潤(rùn)性癌患者外周血中特異性高表達(dá)。
　　2.乳腺浸潤(rùn)性癌患者外周血

13、中hMAM mRNA表達(dá)與腫瘤腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)及臨床分期無(wú)關(guān)。
　　3.乳腺癌患者外周血hMAM mRNA SYBR Green RT-PCR檢測(cè)可以代替CTC檢測(cè)用于監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移及評(píng)估預(yù)后。
　　第三部分 膜相關(guān)型hMAM的鑒定及對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響
　　目的:
　　明確膜相關(guān)型hMAM蛋白的存在，初步探討膜相關(guān)型hMAM蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞ZR75-1體外增殖的影響。
　　方法:<

14、br>　　免疫組織化學(xué)染色在體內(nèi)組織水平證實(shí)hMAM蛋白的乳腺癌細(xì)胞特異性細(xì)胞膜表達(dá)方式;Western Blot在體外細(xì)胞水平證實(shí)hMAM乳腺癌細(xì)胞表面表達(dá)模式。以抗人hMAM抗體處理乳腺癌細(xì)胞ZR75-1，并設(shè)置無(wú)關(guān)抗體對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照，不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔490nm波長(zhǎng)吸光度值，MTT法評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖活性。采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，成組資料間的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

15、意義。
　　結(jié)果:
　　1.免疫組化染色檢測(cè)171例乳腺癌組織中hMAM蛋白的表達(dá)模式。結(jié)果顯示克隆號(hào)為31A5抗體可特異性識(shí)別乳腺組織腫瘤細(xì)胞表面的hMAM蛋白。以31A5抗體作為檢測(cè)抗體，免疫組化染色分析結(jié)果顯示在食管癌、肝癌、膽囊癌及結(jié)腸癌組織中31A5抗體標(biāo)記結(jié)果均為陰性;此外，31A5抗體在人胃、肝、肺及腎臟組織中的標(biāo)記結(jié)果也均為陰性。
　　2.以31A5作為檢測(cè)抗體，以明確膜表達(dá)的Na+-K+-ATPase

16、作為對(duì)照，Western Blot結(jié)果顯示在5株乳腺癌細(xì)胞中，MDA-MB-231細(xì)胞膜蛋白裂解物中hMAM中等強(qiáng)度表達(dá)，而ZR75-1及MDA-MB415細(xì)胞膜蛋白裂解物中hMAM弱表達(dá)。
　　3.以31A5抗體處理乳腺癌細(xì)胞ZR75-1，結(jié)果顯示，與無(wú)關(guān)抗體對(duì)照、抗體溶媒PBS對(duì)照及培養(yǎng)基對(duì)照相比，31A5抗體處理乳腺癌細(xì)胞ZR75-1后的第3天，腫瘤細(xì)胞增殖活性降低(P＜0.05);與各對(duì)照組相比，其余時(shí)間節(jié)點(diǎn)未顯示細(xì)胞增殖

17、活性的變化。各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)各對(duì)照組之間相比，細(xì)胞增殖活性無(wú)顯著變化。以MDA-MB-231、MDA-MB415及MCF-7細(xì)胞作為檢測(cè)細(xì)胞，與對(duì)照組相比，31A5抗體處理后的各時(shí)間節(jié)點(diǎn)細(xì)胞增殖活性無(wú)顯著變化。
　　結(jié)論:
　　1.在體內(nèi)乳腺癌組織及體外乳腺癌細(xì)胞中均存在膜相關(guān)型hMAM，不同生物學(xué)特性乳腺癌細(xì)胞中膜相關(guān)型hMAM的表達(dá)水平不同。
　　2.細(xì)胞表面MAM介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能在ZR75-1細(xì)胞增殖中發(fā)揮