應用OGF-OGFR治療乳腺癌的實驗研究.pdf

1、乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一。為探討OGFR在乳腺癌中的表達意義及OGF、OGFR相互作用在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究采用RT-PCR方法檢測了正常乳腺、乳腺腺病、乳腺導管上皮異型增生及乳腺浸潤性導管癌組織中OGFR mRNA的表達；采用Western Blotting和免疫組化技術檢測了上述組織中OGFR蛋白的表達；采用免疫組化技術檢測了上述組織中OGF蛋白的表達。通過細胞計數(shù)、MTT實驗、細胞周期分析觀察了OGF對人乳腺

2、癌MCF-7細胞株生長的影響，并觀察了OGF聯(lián)合應用Taxol對人乳腺癌MCF-7細胞株的生長抑制作用。 第一部分 OGF、OGFR在乳腺癌中的表達研究 目的: 觀察OGF、OGFR在乳腺病變中的表達規(guī)律，探討OGF-OGFR與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關系。 方法: 1. 病例采集：18 例正常乳腺、12 例乳腺腺病、8 例乳腺導管上皮異型增生、24 例乳腺浸潤性導管癌組織均為承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院外科術中冰凍送檢及

3、手術切除立即送檢標本。 2. OGFRmRNART-PCR檢測：采用RT-PCR方法檢測OGFR mRNA在乳腺不同病變之間的表達差異。以每例OGFR與β-actin擴增產(chǎn)物條帶光密度的比值作為OGFR mRNA的相對表達量。 3. OGFR在蛋白水平上的表達情況：采用western blotting和免疫組化方法檢測OGFR蛋白在乳腺不同病變之間的表達。Western blotting檢測以每例OGFR與β-actin

4、條帶光密度的比值作為OGFR蛋白的相對表達量，免疫組化檢測以陽性率的形式表示OGFR蛋白的相對表達量。 4. OGF在蛋白水平上的表達情況：采用免疫組化方法檢測乳腺不同病變之間OGF蛋白的表達，以陽性率的形式表示OGF蛋白的相對表達量。 結果: 1. OGFR在正常乳腺組織、乳腺腺病、乳腺導管上皮異型增生和乳腺癌中的表達變化 1.1 OGFR在mRNA水平上的表達情況: RT-PCR結果顯示，正常乳腺組織

5、、乳腺腺病、乳腺導管上皮異型增生和浸潤性導管癌中的OGFR mRNA相對表達量分別為2.4000，1.0562，1.1451和0.6581。正常乳腺組織OGFR mRNA的表達明顯高于乳腺腺病、乳腺導管上皮異型增生和浸潤性導管癌(P<0.05)；乳腺導管上皮異型增生明顯高于乳腺浸潤性導管癌(P<0.05)。OGFR mRNA在乳腺浸潤性導管癌中的表達與患者年齡、腫瘤體積、組織學分級、雌孕激素受體表達、C-erbB-2表達及淋巴結轉移無關

6、(P>0.05)。 1.2 OGFR在蛋白水平上的表達情況: 1.2.1 Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，正常乳腺組織中OGFR蛋白表達量為3.0957，明顯高于乳腺腺病、乳腺導管上皮異型增生和浸潤性導管癌中(分別為2.0632，1.7928和1.1128，P<0.05)；乳腺腺病OGFR蛋白表達量明顯高于浸潤性導管癌(P<0.05)。 1.2.2 免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，OGFR染色陽性物質位于細胞質與細胞核，OG

7、FR的陽性染色在正常乳腺、乳腺腺病、乳腺導管上皮異型增生的腺上皮與肌上皮及癌細胞中均可見到。正常乳腺組織、乳腺腺病、乳腺導管上皮異型增生和浸潤性導管癌中的OGFR蛋白表達陽性率分別為68.80％，44.22％，40.00％和25.52％。正常乳腺組織中明顯高于乳腺腺病、乳腺導管上皮異型增生和浸潤性導管癌中(P<0.01)；乳腺腺病和乳腺導管上皮異型增生中明顯高于乳腺癌中(P<0.01)。 2. OGF在正常乳腺組織、乳腺腺病、乳

8、腺導管上皮異型增生和乳腺癌中的表達變化 免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，OGF染色陽性物質位于細胞質，OGF陽性染色在正常乳腺、乳腺腺病、乳腺導管上皮異型增生的腺上皮與肌上皮及癌細胞中均可見到。浸潤性導管癌組織中OGF的表達陽性率為13.29％，明顯低于正常乳腺組織、乳腺腺病和乳腺導管上皮異型增生(55.43％、43.48％和34.50％，P<0.01)；在乳腺腺病、乳腺導管上皮異型增生中明顯高于乳腺癌中(P<0.01)。 結論:

9、 1. 正常乳腺組織、乳腺腺病、乳腺導管上皮異型增生和乳腺癌組織中均可以檢測到OGFR mRNA和蛋白及OGF蛋白的表達。 2. 從正常乳腺組織、乳腺腺病、乳腺導管上皮異型增生到乳腺癌組織中OGF及OGFR表達均呈逐漸下降的趨勢，提示OGF和OGFR可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展有關。 3. OGFR在mRNA和蛋白水平的表達降低可以作為乳腺癌的標志。 第二部分阿片生長因子抑制乳腺癌細胞生長的實驗研究 目的:

10、 探討OGF對人乳腺癌細胞株MCF-7體外生長及OGFR拮抗劑naloxone對OGF作用的影響。 方法: 1. 免疫組化方法檢測MCF-7細胞中OGF-OGFR的表達 將對數(shù)生長期的細胞用胰酶消化后制成細胞懸液，調(diào)細胞密度在4～5×105/ml，滴加200μl細胞懸液于載玻片上，培養(yǎng)皿中37℃培養(yǎng)24h；丙酮固定后，免疫組化S-P法檢測OGF-OGFR的表達。 2. OGF于體外實驗中最佳抑瘤濃度的確定

11、 取對數(shù)生長期的細胞，將細胞消化后制成細胞懸液，按2×103/孔接種入96孔板，分為10-4、10-5、10-6、10-7M組及空白對照組，每組5個復孔，每孔加入培養(yǎng)基200μl；每24h更換培養(yǎng)基并每孔分別加入2μl OGF，使各種成分保持上述濃度，空白對照組加入0.9％鹽水2μl；采用MTT法檢測加藥后24h、48h、72h、96h吸光度(OD)值，并計算細胞增殖抑制率，選擇最適用藥濃度。 3. OGF對MCF-7細

12、胞生長的抑制作用 結論: 1. 免疫組化檢測結果表明，MCF-7細胞中存在著OGF與OGFR蛋白的表達。 2. 10-4、10-5和10-6的OGF均能抑制MCF-7細胞生長，10-6M可以作為OGF體外實驗中抑制MCF-7細胞生長的最適實驗濃度。 3. OGF于體外實驗中能顯著抑制MCF-7細胞生長，而naloxone能阻斷其生長抑制作用。 第三部分阿片生長因子聯(lián)合紫杉醇抑制乳腺癌細胞生長的實驗

13、研究 目的: 探討OGF聯(lián)合Taxol對MCF-7人乳腺癌細胞生長的抑制作用，進一步觀察應用OGFR拮抗劑naloxone后，OGF及Taxol對細胞生長的差別，探討其作用機制。并通過可逆性實驗，比較OGF和Taxol的細胞毒性。 方法: 1. OGF聯(lián)合Taxol于體外實驗中對乳腺癌細胞生長的影響 將對數(shù)生長期的細胞消化后制成細胞懸液，按2×103/孔接種入96孔板，每孔含培養(yǎng)基200μl。分為OGF處

14、理組、Taxol處理組、OGF聯(lián)合Taxol處理組及空白對照組，每組5個復孔。OGF處理濃度為10-6M、Taxol為10-7 M。分別于接種細胞后24h、48h、72h、96h更換培養(yǎng)基并每孔分別加入2μl OGF、Taxol、OGF和Taxol，使各種成分保持上述濃度，空白對照組加入0.9％鹽水2μl。采用MTT法檢測加藥后24h、48h、72h、96hOD值，并計算細胞增殖抑制率。 2. OGFR拮抗劑naloxone及T

15、axol對OGF于體外實驗中作用于MCF-7細胞產(chǎn)生的影響 將對數(shù)生長期的細胞消化后制成細胞懸液，按2×103/孔接種入96孔板，每孔含培養(yǎng)基200μl。分為naloxone處理組、OGF處理組、OGF/naloxone處理組、Taxol處理組、OGF/Taxol處理組、Taxol/naloxone處理組、OGF/Taxol/naloxone處理組及空白對照組，每組5個復孔。OGF、naloxone處理濃度為10-6M、Taxo

16、l為10-7M。分別于接種細胞后24h、48h、72h、96h更換培養(yǎng)基并每孔分別加入OGF、Taxol、OGF/Taxol、naloxone、OGF/naloxone、Taxol/naloxone、OGF/Taxol/naloxone各2μl，使Taxol保持10-7M，其余各種成分保持10-6M，空白對照組加入0.9％鹽水2μl。采用MTT法檢測加藥后96h的OD值，并計算細胞增殖抑制率； 3. OGF于體外實驗中對乳腺癌細

17、胞生長的可逆性影響 結論: 1. OGF與Taxol聯(lián)合應用對乳腺癌MCF-7細胞具有增強的生長抑制作用，作用效果大于單一成分的作用； 2. naloxone可以阻斷OGF對MCF-7細胞生長的作用，但不能阻斷Taxol的作用，OGF對MCF-7細胞生長的影響是受體(OGFR)介導的，而Taxol的作用無OGFR介導； 3. OGF沒有細胞毒性，能對MCF-7細胞增殖發(fā)揮可逆性的影響，Taxol具有細胞毒