DOX-rPAA@SPION治療乳腺癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景:
　　 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，40-70歲是乳腺癌的高危年齡。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年約有130萬(wàn)人診斷為乳腺癌，50萬(wàn)人死于乳腺癌，乳腺癌已經(jīng)成為婦女健康的最大威脅之一。
　　 乳腺癌的治療手段目前主要有手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療及分子靶向治療等。其中，化療在乳腺癌綜合治療中具有非常重要的地位，而葸環(huán)類藥物是被公認(rèn)的治療乳腺癌最有效的藥物之一，但與其它化療藥物一樣，葸環(huán)類藥物的毒副反應(yīng)較

2、大，尤其是其劑量累積性心臟毒性限制了它的應(yīng)用。為解決這一問題，靶向給藥方式受到高度重視，而納米技術(shù)在靶向給藥的研究中被廣泛應(yīng)用。
　　 納米材料指直徑在1-100nm之間的物質(zhì)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，稍微大一點(diǎn)直徑的顆粒也稱為納米材料。納米材料因其直徑非常小的特點(diǎn)而具有區(qū)別于傳統(tǒng)材料不同的性質(zhì)特點(diǎn)，包括表面效應(yīng)、體積效應(yīng)及量子尺寸效應(yīng)。納米顆粒憑借這些獨(dú)特的性質(zhì)特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于工程、化學(xué)、生物及醫(yī)學(xué)等方面。
　　 在醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)

3、領(lǐng)域，納米材料主要作為載體來(lái)承載化療藥物、細(xì)胞因子、抗體等，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行靶向治療，從而提高藥物療效、減輕毒副作用、提高生物利用度。納米藥物載體主要分為以下4類:1.普通載藥納米顆粒，將藥物與納米顆粒直接高度結(jié)合，提高原本理化性質(zhì)不穩(wěn)定而易降解的藥物的生物利用度;2.靶向定位載藥納米顆粒，其表面有腫瘤靶向配體，使藥物準(zhǔn)確地輸送到腫瘤病灶，提高療效、減少全身毒副反應(yīng);3.磁性載藥納米顆粒，其內(nèi)部有氧化鐵，氧化鐵的超順磁性使藥物在外加磁場(chǎng)下

4、達(dá)到被動(dòng)靶向和MRI顯像的目的;4.多功能型載藥納米顆粒，是集載藥、智能釋藥、靶向、顯像等多種功能于一體的納米顆粒。
　　 理想的納米材料作為藥物載體需要具有以下特點(diǎn):性質(zhì)穩(wěn)定，無(wú)毒、無(wú)刺激性，不致畸，顆粒直徑小且分布窄;能夠保護(hù)藥物增加其穩(wěn)定性;可以感應(yīng)外界環(huán)境如酸堿、溫度、酶及氧化還原劑等;可以連接配體并能承載多種藥物;可以集載藥及顯像等多功能于一體。目前研究比較多的納米材料有脂質(zhì)體、超順磁氧化鐵、量子點(diǎn)及高分子聚合物等。聚

5、合物又分為無(wú)機(jī)類分子和有機(jī)類分子，無(wú)機(jī)類分子包括納米羥基磷灰石和介孔硅基材料，有機(jī)類分子分為有機(jī)小分子和高分子材料，高分子材料分為天然大分子和人工合成大分子如乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、兩親性共聚物等。高分子材料具有良好的生物相容性和可降解性能等優(yōu)點(diǎn)，是一種非常有前景的納米材料。脂質(zhì)體，它是類似生物膜結(jié)構(gòu)的雙分子小囊，具有單個(gè)或多個(gè)雙層磷脂膜的囊泡，其主要成分是磷脂，磷脂分子中磷酸基團(tuán)具有親水性，碳?xì)滏溇哂惺杷?它免疫原性小且有

6、較好的生物相容性;它可以使藥物緩釋，延長(zhǎng)藥物半衰期長(zhǎng)及藥效持續(xù)時(shí)間;因?yàn)槟[瘤生長(zhǎng)部位毛細(xì)血管的通透性增加及細(xì)胞的主動(dòng)內(nèi)吞，載藥脂質(zhì)體可以直接滲透至腫瘤部位提高藥物療效，同時(shí)避免高濃度游離藥物滲透正常組織從而降低全身毒副反應(yīng)。另外，超順磁氧化鐵作為最有希望的納米顆粒被廣泛研究，這主要源于其超順磁性使納米顆粒在外加磁場(chǎng)下定向移動(dòng)，從而使納米顆粒聚集于靶區(qū)并且能被核磁共振顯像，達(dá)到藥物靶向、示蹤及監(jiān)測(cè)目的。然而，單純氧化鐵納米顆粒在水中很不穩(wěn)

7、定，一些疏水材料如油酸、聚乙二醇、普朗克尼、PLGA等可以包被氧化鐵顆粒，使其生物相容性明顯增加。研究者們?cè)诓粩嘣黾哟判约{米顆粒的生物相容性的同時(shí)，也在不斷探索藥物智能釋放的方法。已有研究報(bào)道，一些納米材料可以在外界環(huán)境如氧化還原劑、溫度、PH等刺激下降解實(shí)現(xiàn)藥物的智能釋放。然而，這些研究多數(shù)停留在化學(xué)反應(yīng)的水平，少數(shù)涉及細(xì)胞水平，動(dòng)物水平的相關(guān)研究更是鮮有。
　　 為實(shí)現(xiàn)阿霉素靶向給藥，我們采用阿霉素/聚酰胺@超順磁氧化鐵納米

8、顆粒(doxorubicine/rPAA@superparamagnetic iron oxide nanoparticles,DOX/rPAA@SPION)，在動(dòng)物水平，對(duì)其治療乳腺癌的療效、毒副反應(yīng)、生物分布及MRI顯像進(jìn)行研究。DOX/rPAA@SPION主要有3部分組成:阿霉素(DOX)，以rPAA為骨架的高分子聚合物(reducible polyamidoamine graftpoly(ethylene glycol)/dod

9、ecyl amine copolymers，rPAA)，超順磁氧化鐵(SPION)。由于DOX/rPAA@SPION可以在外部磁場(chǎng)的作用下集中于腫瘤組織，因而可達(dá)到被動(dòng)靶向給藥和核磁共振顯像示蹤監(jiān)測(cè)的目的;此外rPAA含叔胺及二硫鍵，對(duì)酸及還原劑敏感，而腫瘤組織內(nèi)酸性高、還原劑豐富，到達(dá)腫瘤部位的DOX/rPAA@SPION納米顆粒rPAA降解釋放阿霉素，殺滅腫瘤細(xì)胞，提高療效;納米顆粒獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)也可以降低化療藥物毒副反應(yīng)及延長(zhǎng)藥物

10、半衰期。
　　 目的:
　　 1.通過(guò)建立MDA-MB231乳腺癌裸鼠模型，探索DOX/rPAA@SPION磁性納米顆粒在動(dòng)物水平的抑瘤效果。
　　 2.通過(guò)觀察裸鼠活動(dòng)狀態(tài)、體重變化及對(duì)心臟、肝臟、腎臟進(jìn)行HE染色，了解DOX/rPAA@SPION磁性納米顆粒在體內(nèi)的毒副反應(yīng)。
　　 3.通過(guò)對(duì)裸鼠腫瘤組織、心臟、肝臟、腎臟進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，檢測(cè)DOX/rPAA@SPION磁性納米顆粒在體內(nèi)分布情況。<

11、br>　　 4.通過(guò)對(duì)尾靜脈注射DOX/rPAA@SPION前、注射后12h及24h的荷瘤裸鼠進(jìn)行MRI顯像，探討應(yīng)用MRI對(duì)DOX/rPAA@SPION納米顆粒進(jìn)行顯像及監(jiān)測(cè)的可行性。
　　 方法:
　　 1.培養(yǎng)MDA-MB231乳腺癌細(xì)胞:復(fù)蘇細(xì)胞，采用含10％胎牛血清的Leibovitz's15(L-15)培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將5×106細(xì)胞溶解于150ul無(wú)血清L-15培養(yǎng)基中

12、。
　　 2.從南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買5周齡裸鼠，SPF級(jí)飼養(yǎng)，觀察裸鼠活動(dòng)、覓食、精神狀態(tài)等，約1周左右裸鼠完全適應(yīng)新環(huán)境。
　　 3.建立MDA-MB231裸鼠乳腺癌模型:將第1步得到的150ul MDA-MB231細(xì)胞懸液震蕩混勻，注射于完全適應(yīng)環(huán)境的裸鼠右側(cè)脅肋部皮下。
　　 4.DOX/rPAA@SPION磁性納米顆粒的溶解及磁性驗(yàn)證:清潔并用75％酒精消毒細(xì)胞超聲粉碎儀，將適量無(wú)菌PBS溶液移入

13、裝有DOX/rPAA@SPION納米顆粒沉淀的容器內(nèi)，探頭置于PBS液面下，調(diào)節(jié)超聲功率至200w，維持30min。待沉淀完全溶解后，置于磁場(chǎng)觀察納米顆粒的順磁性。
　　 5.DOX/rPAA@SPION磁性納米顆粒療效研究:待乳腺癌裸鼠腫瘤體積達(dá)50mm3左右，將其中腫瘤大小較為一致的21只裸鼠分為3組(n=7)，對(duì)照組（Control）、阿霉素組(DOX)、磁性納米組（DOX/rPAA@SPION），分別注射生理鹽水、阿霉素

14、和DOX/rPAA@SPION納米顆粒。具體為Control組每只裸鼠尾靜脈注射200ul生理鹽水，DOX組阿霉素7mg/kg，d1、d8，而DOX/rPAA@SPION組(DOX∶Fe=1∶10)也是阿霉素7mg/kg，d1、d8。DOX/rPAA@SPION組裸鼠每次尾靜脈注射后立即于腫瘤表面放置磁鐵，并持續(xù)1.5小時(shí)。治療期間及處死前，隔天測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑及短徑，計(jì)算體積;治療后24天將裸鼠處死后稱重腫瘤組織，計(jì)算抑制率。
　　

15、 6.DOX/rPAA@SPION磁性納米顆粒毒副反應(yīng)及生物分布:治療期間及治療后，觀察裸鼠活動(dòng)、精神狀態(tài)，并稱體重。治療后24天，離斷頸髓法將裸鼠處死，剝離裸鼠腫瘤、心臟、肝臟、腎臟，將其置于4％多聚甲醛中固定約24h，石蠟包埋、切片、HE染色及普魯士藍(lán)染色。
　　 7.DOX/rPAA@SPION磁性納米顆粒體內(nèi)MRI顯像:從剩下的荷瘤裸鼠中挑選7只用于MRI顯像，DOX/rPAA@SPION顆粒中DOX∶Fe=1∶10。

16、分別在注射DOX/rPAA@SPION納米顆粒(Fe70mg/kg，相當(dāng)于阿霉素一次治療量)前、注射后12h及注射后24h，采用1％戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉裸鼠，劑量為70mg/kg，待裸鼠麻醉完全，將其固定，進(jìn)行MRI顯像。MRI成像參數(shù):1.5T飛利浦，冠狀位，橫斷面，T2-加權(quán)TSE(TR/TE=3500/120ms，F(xiàn)OV=170，68,17mm,matrix=260×157, NEX=4,thickness/interval

17、=2/0.6mm)。
　　 結(jié)果:
　　 1.DOX/rPAA@SPION磁性納米顆粒沉淀通過(guò)超聲粉碎儀震蕩溶解，基本完全溶解，外加磁場(chǎng)后DOX/rPAA@SPION迅速移向磁鐵，溶液變得清亮，說(shuō)明DOX/rPAA@SPION順磁性良好。
　　 2.DOX/rPAA@SPION磁性納米顆粒的療效:治療后第4天，對(duì)照組腫瘤體積為137.47±20.62mm3，阿霉素組腫瘤體積為122.79±21.19mm3，DOX

18、/rPAA@SPION磁性納米組腫瘤體積為51.70±7.92mm3;DOX/rPAA@SPION組腫瘤體積不但顯著小于對(duì)照組(p=0.000)，也顯著小于阿霉素組(p=0.000)，阿霉素組與對(duì)照組相比腫瘤大小無(wú)顯著差異(p=0.138)。治療后8天，對(duì)照組小鼠腫瘤體積為259.88±7.70mm3，阿霉素組腫瘤體積為195.48±9.77mm3，DOX/rPAA@SPION組腫瘤體積為72.08±6.06mm3，阿霉素組及DOX/r

19、PAA@SPION組腫瘤體積明顯小于對(duì)照組腫瘤體積，DOX/rPAA@SPION組腫瘤體積小于阿霉素組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。治療后24天，對(duì)照組腫瘤體積為1378.29±104.85mm3，阿霉素組腫瘤體積為838.02±189.45mm3，DOX/rPAA@SPION組腫瘤體積為247.31±60.14mm3，DOX/rPAA@SPION組腫瘤體積小于對(duì)照組及阿霉素組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。治療24天后，阿霉素的

20、腫瘤抑制率為41.67％，DOX/rPAA@SPION的腫瘤抑制率為76.96％，明顯高于阿霉素。
　　 3.DOX/rPAA@SPION磁性納米顆粒毒副反應(yīng):對(duì)照組裸鼠治療當(dāng)天體重為19.36±0.35(g)，阿霉素組體重為19.39±0.37(g)，DOX/rPAA@SPION組體重為19.37±0.35(g)，治療期間及治療后，3組體重均無(wú)明顯減輕，組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。此外，3組裸鼠精神狀態(tài)及活動(dòng)能力一直良好

21、，未見明顯活動(dòng)異常。HE染色結(jié)果顯示3組腫瘤組織均見不同程度的壞死。與空白對(duì)照組一樣，阿霉素組和DOX/rPAA@SPION組裸鼠的心臟、肝臟、腎臟均未見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、組織壞死及纖維化等病理變化。
　　 4.DOX/rPAA@SPION磁性納米顆粒在治療后24天在裸鼠體內(nèi)的生物分布:普魯士藍(lán)染色是針對(duì)鐵離子的檢測(cè)方法，相比空白對(duì)照組及阿霉素組，DOX/rPAA@SPION組的腫瘤、心臟、肝臟、腎臟未見明顯的鐵沉積。

22、　　 5.DOX/rPAA@SPION磁性納米顆粒24小時(shí)內(nèi)MRI顯像結(jié)果:注射DOX/rPAA@SPION前，裸鼠腫瘤病灶的T2加權(quán)像信號(hào)相對(duì)較高，肺及肝信號(hào)正常;注射磁性納米顆粒后12h，裸鼠腫瘤病灶信號(hào)變低，肺及肝臟信號(hào)也明顯降低;注射磁性納米顆粒后24h，裸鼠腫瘤病灶、肺及肝臟信號(hào)較注射前低、較注射后12h略高。
　　 結(jié)論:
　　 1.DOX/rPAA@SPION納米顆粒對(duì)MDA-MB231乳腺癌動(dòng)物模型的腫

23、瘤生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，抑瘤效果好于阿霉素。
　　 2.DOX/rPAA@SPION納米顆粒治療期間及治療后，裸鼠精神狀態(tài)良好且各臟器無(wú)明顯病理學(xué)變化，提示其毒副反應(yīng)低，生物安全性良好。
　　 3.DOX/rPAA@SPION磁性納米顆粒治療后24天，腫瘤組織及各臟器未見鐵沉積，提示其代謝快，生物相容性好。
　　 4.MRI可以顯像示蹤DOX/rPAA@SPION磁性納米顆粒，實(shí)現(xiàn)腫瘤病灶納米顆粒的可視化及實(shí)時(shí)監(jiān)