靶向微泡介導兔易損斑塊新生血管超聲分子顯像及CXCR4在AS演進中的研究.pdf

1、背景和目的：
　　 動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是影響人類健康的主要疾病，絕大多數(shù)患者在沒有任何前驅(qū)癥狀情況，死于急性心血管事件。近年來研究發(fā)現(xiàn)，導致急性心血管病事件的主要原因是動脈粥樣硬化斑塊破裂和動脈血栓形成，而這主要取決于斑塊的易損性(vulnerability)，易損斑塊(vulnerable plaque，VP)及不穩(wěn)定斑塊破裂是導致急性冠狀動脈綜合征重要因素之一。除目前國際公認的易損斑塊診斷指

2、標：脂質(zhì)池體積、炎性細胞浸潤數(shù)量及纖維帽厚度之外，斑塊新生血管密度及分布亦是衡量斑塊易損性和穩(wěn)定性的一項重要指標。新生血管是動脈粥樣硬化斑塊一個重要病理學特征，也是動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的重要危險因素。靶向超聲對比顯像技術(shù)是分子水平顯影成像技術(shù)之一，利用超聲造影劑(微泡)表面固有的生物學特性，或者通過對微泡表面連接特異性的抗體或配體，構(gòu)建具有靶向能力超聲微泡造影劑，經(jīng)靜脈注入體內(nèi)后靶向性聚集于靶目標，對于臨床診斷、治療療效以及藥物開發(fā)等諸

3、多方面均有重要意義。因此，通過具有靶向能力的影像學技術(shù)檢測斑塊內(nèi)新生血管，在辨識斑塊穩(wěn)定性，預防心腦血管事件的發(fā)生等方面具有重要作用。
　　 血管內(nèi)皮生長因子受體2(Vascular endothelial growth factor receptor2，VEGFR-2)作為重要的血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)的主要受體，VEGFR-2高表達于易損斑塊新生血管的

4、內(nèi)皮細胞。VEGF主要通過兩個絡(luò)氨酸激酶受體發(fā)揮作用：VEGF receptor-1(Flt-1)和VEGF receptor-2(KDR/Flk-1)，VEGFR-2具有促進血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移，增加血管通透性等作用。本實驗應(yīng)用生物素-親和素-生物素橋連方法制備攜VEGFR-2單抗靶向微泡造影劑，利用高頻超聲對比造影技術(shù)無創(chuàng)性動態(tài)觀測活體兔腹主動脈易損斑塊新生血管的增強顯影效果，斑塊顯影強度與相應(yīng)的斑塊VEGFR-2免疫組織化學染色

5、量化結(jié)果進行相關(guān)性分析，并與血脂水平和病理學檢查相結(jié)合，初步探討一種檢測易損斑塊新生血管靶向增強顯影的超聲分子成像技術(shù)。
　　 有研究證實了斑塊內(nèi)血管生成在動脈粥樣硬化形成與發(fā)展中具有重要作用，動脈粥樣硬化中的新生血管大部分為不成熟，周細胞和平滑肌細胞數(shù)量缺乏，其通透性較大，有利于炎癥細胞滲透進入斑塊內(nèi)部，促進炎癥反應(yīng)發(fā)生，增加斑塊不穩(wěn)定性與易損性。因此，深入研究和理解動脈粥樣硬化血管生成的過程及其調(diào)控機理，對于促進抗血管生成治

6、療粥樣斑塊，增加斑塊穩(wěn)定性都具有重要意義。趨化因子是一類超家族的細胞因子，由于基質(zhì)細胞衍生因子1α(stromal cell derived factor1α，SDF-1α)靠近N端的2個半胱氨酸被一個其他的氨基酸隔開而被歸為CXC亞家族。它的唯一受體是趨化因子受體4(chemokine receptor4，CXCR4)，CXCR4在單核細胞、淋巴細胞、平滑肌中均有表達，它們都是與動脈粥樣硬化形成過程相關(guān)的主要細胞成分。有研究發(fā)現(xiàn)CXC

7、R4能促進腫瘤組織轉(zhuǎn)移及血管形成，但它在動脈粥樣硬化血管生成中的研究鮮有報道。本研究通過建立動脈粥樣硬化模型，檢測不同時間點趨化因子受體CXCR4與血管內(nèi)皮生長因子VEGF表達變化及其相關(guān)性，初步探討趨化因子受體CXCR4在動脈粥樣硬化斑塊血管生成中的作用及可能機制。
　　 方法：
　　 1.短肽GL-7靶向微泡造影劑對高脂飲食兔腹主動脈內(nèi)膜體外特異性結(jié)合及體內(nèi)增強顯影效果：
　　 高脂飲食法建立兔腹主動脈內(nèi)膜損

8、傷模型后隨機分為兩組：分別使用靶向和非靶向微泡造影劑行腹主動脈超聲造影觀察。視頻密度法評價兩種造影劑對動脈內(nèi)膜增強顯影效果。免疫熒光染色觀察兩種造影劑與動脈內(nèi)膜特異性結(jié)合及熒光染色強度差異。
　　 2.VEGFR-2靶向微泡造影劑介導兔腹主動脈易損斑塊新生血管超聲分子顯像：
　　 采用球囊損傷血管內(nèi)皮+高脂飼料喂養(yǎng)+p53腺病毒轉(zhuǎn)染的方法，模擬人類易損斑塊病理學特點，建立兔腹主動脈易損斑塊模型，利用高頻超聲對比造影技術(shù)無

9、創(chuàng)性動態(tài)觀測活體兔腹主動脈易損斑塊新生血管增強顯影效果，斑塊顯影強度與相應(yīng)的斑塊VEGFR-2免疫組織化學結(jié)果進行相關(guān)性分析，并與血脂水平和病理學檢查相結(jié)合。
　　 3.兔動脈血管中趨化因子受體CXCR4與血管內(nèi)皮生長因子VEGF表達變化及其相關(guān)性：
　　 新西蘭大白兔高脂飼料喂養(yǎng)+球囊拉傷腹主動脈法建立動脈粥樣硬化模型，分別于第4、8、12周末處死動物，截取腹主動脈血管，蛋白質(zhì)印跡Western Blot法檢測CXCR

10、4蛋白含量變化。熒光定量PCR法檢測VEGFmRNA表達變化，結(jié)果進行相關(guān)性統(tǒng)計學分析。免疫組織化學染色法檢測動脈粥樣硬化斑塊CXCR4、CD34表達與定位。
　　 結(jié)果：
　　 1.靶向、非靶向微泡造影劑造影后血管內(nèi)膜回聲均較造影前增強，靶向造影組較非靶向造影組血管內(nèi)膜峰值視頻強度比較，差異有統(tǒng)計學意義(137.49±13，56 dB vs111.24±15.23 dB；P<0.05)。熒光顯微鏡下觀察，靶向微泡造影組

11、與動脈內(nèi)膜特異性結(jié)合呈明亮綠色熒光表達，而非靶向造影組內(nèi)膜面呈微弱綠色熒光，兩組熒光強度比較有統(tǒng)計學差異(76.74±13.64 vs31.17±14.81；P<0.05)。
　　 2.生物素-親和素法成功制備VEGFR-2靶向微泡造影劑。建立兔腹主動脈易損斑塊模型具有人類易損斑塊基本病理學特點。12周末，靶向微泡造影組視頻強度與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(144.42±17.70 dB vs106.88±9.38dB；Z=-3

12、.984，P=0.000)。靶向VEGFR-2微泡造影組動脈斑塊視頻強度與相應(yīng)VEGFR-2免疫組織化學陽性表達呈顯著正相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)(r2=0.78，P=0.001)，而與此相反在對照組，Pearson相關(guān)分析結(jié)果表明與相應(yīng)VEGFR-2表達水平之間無相關(guān)關(guān)系，Pearson相關(guān)系數(shù)((r2=0.17，P=0.301)。
　　 3.兔動脈粥樣硬化模型第4、8、12周3個時相點動脈血管CXCR4蛋白含量分別為：(0

13、.46±0.03)、(0.58±0.05)、(0.65±0.07)；動脈血管VEGF mRNA表達為(1.04±0.24)、(1.99±0.21)、(3.97±0.75)，兩者之間呈顯著正相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)r2=0.869，P<0.05)。免疫組織化學CXCR4染色在血管內(nèi)膜及斑塊內(nèi)部可見多處陽性染色，CD34陽性染色于血管內(nèi)皮細胞，動脈斑塊內(nèi)可見豐富的新生血管，棕黃色陽性表達。
　　 結(jié)論：
　　 1.短肽G

14、L-7靶向微泡造影劑與兔動脈血管內(nèi)膜體內(nèi)、體外特異性結(jié)合，并可顯著增強高脂飲食兔腹主動脈內(nèi)膜靶向增強顯影。
　　 2.VEGFR-2靶向超聲對比分子顯像的方法對觀察兔易損斑塊新生血管表達具有良好的相關(guān)性與特異性，為采用靶向超聲分子顯像的方法在體無創(chuàng)性評估兔易損斑塊新生血管奠定了初步的實驗基礎(chǔ)。
　　 3.兔腹主動脈粥樣硬化進程中，趨化因子受體CXCR4和血管內(nèi)皮生長VEGF表達含量呈正相關(guān)，趨化因子受體CXCR4可能在斑