基于KDR為靶點的靶向超聲微泡對腫瘤新生血管分子顯像的研究.pdf

1、背景與目的:
　　 新生血管在腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，隨著對腫瘤血管生成分子機制認識的逐漸深入，以腫瘤血管異質(zhì)性為基礎(chǔ)的血管功能性分子標記物不斷開發(fā)，使以腫瘤新生血管為靶點的腫瘤分子成像成為可能。現(xiàn)有的超聲造影劑粒徑多在1-8um左右，診斷條件下難以透過血管壁的細胞間隙進入組織間質(zhì)，是真正意義上的血池造影劑，與其它在分子水平用于評價腫瘤血管生成的影像學方法如CT、MRI，PET等比較，無造影劑外滲致背景信號增高的

2、缺陷，造影增強信號完全來自于腫瘤血管床，同時超聲技術(shù)具有較好的空間分辨率和實時顯像功能，操作簡便，無輻射損傷，更適合用于腫瘤血管生成的研究。
　　 研究表明，在實體瘤發(fā)生的早期階段已有血管生成開關(guān)的啟動。KDR作為最重要的血管生長因子VEGF的主要受體，介導VEGF的內(nèi)皮細胞增殖、遷移、血管通透性增加等促血管生成活性，在腫瘤血管生成過程尤其是早期階段起著關(guān)鍵作用。本課題組前期的研究證實從人正常乳腺-單純增生-非典型增生-乳腺原位

3、癌-乳腺浸潤性癌這一發(fā)生與演進過程中，KDR表達逐漸增高增強，尤其在乳腺原位癌及乳腺浸潤性癌的血管內(nèi)皮細胞呈持續(xù)高表達，表明以KDR為靶點進行乳腺癌新生血管分子顯像可能為乳腺癌的早期診斷提供新的思路。KDR高表達于乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等多種腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞，與腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示KDR可能成為多種實體瘤新生血管特異性分子顯像的靶標并用于評價腫瘤血管生成狀態(tài)，估測預(yù)后及進一步用于抗血管生成治療療效監(jiān)測。
　　 靶向

4、超聲分子顯像在血栓、炎癥、動脈粥樣硬化以及腫瘤新生血管的評價方面已取得初步成果。目前與超聲微泡連接用于超聲分子顯像的配體主要以抗體居多，抗體與靶細胞表面抗原結(jié)合特異性強，但抗體明顯的免疫原性，分子量過大，受其表面修飾位點限制顯像靈敏度不夠高的缺陷限制了以抗體為導向分子的靶向造影劑在體內(nèi)應(yīng)用。因此，本實驗中我們選擇分子量小，與靶點結(jié)合特異性強的短肽作為與超聲造影劑結(jié)合的配體，將從噬菌體肽庫中篩選到的與KDR有高親和活性的12肽K237通過

5、生物素-親和素橋與脂質(zhì)體微泡偶連，構(gòu)建靶向微泡，體外實驗鑒定其生物活性，同時建立裸鼠移植瘤模型進行超聲造影顯像，探討以KDR為靶點進行乳腺癌新生血管分子靶向超聲顯像的可行性。
　　 材料與方法:
　　 1.短肽的合成
　　 參照文獻方法固相合成與KDR有高親和活性的氨基酸序列為(HTMYYHHYQHHL)的生物素化十二肽以及含隨機序列的對照肽，高效液相色譜法測定化學純度，柱層析法進行純化分離，收集主峰進行質(zhì)譜分析

6、。
　　 2.DiI紅色熒光標記的靶向微泡的制備
　　 按摩爾比稱取一定量的DSPC、DPPE-Biot于三頸瓶中，并加入DiI染料、PEG4000、泊洛沙姆(F188)，加25ml蒸餾水，于70℃水浴攪拌30min，放冷至室溫。把制好的脂質(zhì)混懸液加入50ml聚丙烯管內(nèi)，將剪切刀頭插至液面下，通入全氟丙烷2min氣體，以一定的剪切速度剪切一定時間，制得包裹全氟丙烷氣體的脂質(zhì)微泡，分裝于西林瓶中充入全氟丙烷氣體密閉，制備得

7、到生物素化DiI紅色熒光標記的脂質(zhì)微泡。生物素化脂質(zhì)微泡加入鏈親和素，冰上孵育30min，純化洗滌后再分別加入生物素化12肽或含隨機序列的對照肽，冰上孵育30min，洗滌純化后即制備出靶向微泡(MBp)和對照微泡(MBc)，4℃冰箱保存。
　　 3.靶向微泡理化性質(zhì)鑒定
　　 同上述步驟制備生物素化的DiI紅色熒光標記的普通微泡，加入鏈親和素，洗滌純化后加入FITC標記的生物素化12肽，冰上孵育30min，洗滌純化后即制

8、備出FITC標記的靶向微泡(FITC-MBp)。庫爾特計數(shù)儀進行粒度分析，光鏡及熒光顯微鏡觀察微泡形態(tài)、熒光分布，熒光顯微鏡下觀察FITC綠色熒光標記的小肽與DiI紅色熒光標記的微泡的連接情況。
　　 4.靶向微泡體外靶向試驗
　　 4.1.體外靶向試驗:細胞免疫熒光及WesternBlot檢測人結(jié)腸癌癌LOVO細胞、人乳腺癌MDA-MB-231細胞、人結(jié)腸癌LS174T細胞KDR表達情況，DiI標記的靶向微泡(MBp)

9、及DiI標記的對照微泡(MBc)分別與三種細胞孵育30min，DAPI染核后，普通光鏡及熒光顯微鏡下觀察微泡與三種細胞的粘附情況，取10個隨機視野，計數(shù)每個視野內(nèi)平均每個細胞周圍粘附的微泡數(shù)量，比較三種細胞周圍粘附的微泡數(shù)量的差異。
　　 4.2.阻斷試驗:將一定量的K237與LOVO細胞孵育30min后滴加DiI標記的靶向微泡(MBp)，DAPI染核后，普通光鏡及熒光顯微鏡下觀察微泡與LOVO細胞的粘附情況，取10個隨機視野，

10、計數(shù)每個視野內(nèi)平均每個細胞周圍粘附的微泡數(shù)量，并與未封閉組比較有無差異。
　　 4.3.統(tǒng)計學分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)均以(x)±s表示。三種細胞與靶向微泡之間的粘附情況選用近似F檢驗Welch法進行方差分析;組間多重比較采用DunnetT3檢驗。LOVO細胞靶向微泡與對照微泡之間采用兩獨立樣本t檢驗;LOVO細胞靶向組與阻斷組微泡粘附數(shù)量比較采用兩獨立樣本t檢驗。
　　 5.動物模

11、型的建立收集處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞、LS174T細胞（培養(yǎng)于含10％血清的1640培養(yǎng)基，37℃、5％CO2孵箱培養(yǎng)）制成濃度為5.0x107/ml的細胞懸液。6-8周齡雌性裸鼠36只，隨機選取18只注射MDA-MB-231細胞，余注射LS174T細胞。每鼠無菌條件下局部消毒，于裸鼠皮下第三對乳腺脂肪墊處緩慢注射0.1ml的細胞懸液，見局部形成隆丘后退針，定期觀察腫瘤生長情況。
　　 6.動物體內(nèi)超聲造影成像及

12、對比圖像分析
　　 6.1.實驗分組:36只移植瘤模型裸鼠分為兩組，MDA-MB-231、LS174T移植瘤模型各18只;兩組移植瘤模型裸鼠各組隨機選12只移植瘤模型行靶向微泡超聲造影檢查，各組余6只小肽預(yù)先封閉后再行靶向微泡超聲造影檢查。
　　 6.2.靶向超聲造影實驗:取MDA-MB-231、LS174T移植瘤裸鼠各12只，10天后行MBp和MBc超聲造影檢查。麻醉后裸鼠仰臥位固定于自制平臺上。將探頭放于支架上并調(diào)整

13、探頭使腫瘤能夠良好顯像。CEU檢查選用采用二次諧波成像（secondharmonicimaging）技術(shù)進行，探頭發(fā)射頻率為10.0MHz，接收頻率為14MHz機械指數(shù)(MechanicalIndex，MI)為0.14，實驗過程中各項參數(shù)及探頭位置保持不變。所有裸鼠經(jīng)尾靜脈分別隨機注射0.2ml濃度為2.0x108/ml的靶向微泡、對照微泡(時間間隔為30min)。注入微泡5min后獲取腫瘤聲學造影第一幀圖像，此后，以高MI(1.9)連

14、續(xù)超聲發(fā)射2～3s破壞微泡后，繼續(xù)存儲圖像3-4幀。全部聲學造影圖像存于DVD盤，以備脫機分析。
　　 6.3.小肽阻斷試驗:兩組瘤鼠各6只，以0.2mlK237小肽預(yù)先注射30min后再注射2.0(×)108/ml靶向微泡0.2ml，造影方法及圖像處理同前。
　　 6.4.圖像分析:應(yīng)用MCE軟件對超聲圖像進行分析，測量實驗裸鼠腫瘤顯影各個圖像的聲強度(videointensity,(Ⅵ))，其中第一幀圖像的聲強度值代

15、表微泡在組織及循環(huán)中的總濃度，包括腫瘤組織的粘附和體內(nèi)血液循環(huán)的微泡，高機械指數(shù)超聲波破壞后的聲強度值為血液循環(huán)中的微泡濃度，前者減去后者即得到粘附在腫瘤組織中的微泡濃度。采用彩色編碼技術(shù)制作腫瘤組織及周邊組織彩色編碼圖像。
　　 6.5.統(tǒng)計學分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，所有數(shù)據(jù)均以(x)±s表示。腫瘤組織內(nèi)靶向微泡、對照組微泡、阻斷組(Ⅵ)值比較均采用One-WayANOVA，方差不齊則選用近似F檢

16、驗Welch法進行方差分析;組間多重比較方差齊性采用LSD檢驗，方差不齊采用DunnetT3檢驗。
　　 7.動物活體熒光成像
　　 所有裸鼠行超聲造影后次日進行活體熒光成像。裸鼠以4％的戊巴比妥鈉0.2ml腹腔麻醉。麻醉后裸鼠仰臥位固定于自制平臺上，隨機選取24只（兩組腫瘤各12只）分別經(jīng)尾靜脈注入DiI熒光標記的靶向微泡MBp、對照微泡MBc，余裸鼠則以K237小肽封閉30min后再注射DiI熒光標記的靶向微泡MBp

17、，微泡劑量、濃度及時間間隔同超聲造影。注入微泡后，采用KODAKImageStation4000MMDigital系統(tǒng)，采用549nm的激發(fā)光，發(fā)射波長為564nm，觀察各組微泡在腫瘤部位的粘附情況。
　　 8.腫瘤組織免疫組化分析
　　 處死裸鼠，取出裸鼠腫瘤組織及瘤周正常組織，4％多聚甲醛固定，行免疫組化檢查，檢測組織內(nèi)KDR表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.高效液相色譜及質(zhì)譜分析:合成肽高效液相色

18、譜分析主峰測定值為2522.9D，與理論分子量2523.6D基本符合，主峰含量約98.5％，合成成功。
　　 2.超聲微泡理化性質(zhì):制備得到的靶向脂質(zhì)體微泡(MBp)和對照微泡(MBc)普通光鏡下觀察分布均勻，無聚集現(xiàn)象，單個微泡外觀圓整。庫爾特計數(shù)儀測得MBp濃度約為(5.17±1.0)x108個/ml，粒徑為（2.01±0.93）μm，MBc濃度約為(5.37±1.07)x108個/ml，粒徑為（2.10±1.03）μm。熒

19、光顯微鏡下見FITC標記的靶向微泡(FITC-MBp)外殼發(fā)出明亮的黃色熒光，表明熒光標記的小肽與DiI標記的微泡外殼連接良好。
　　 3.靶向微泡體外性能鑒定
　　 3.1.結(jié)合試驗:細胞免疫熒光及WesternBlot結(jié)果顯示，LOVO細胞呈KDR強陽性表達，MDA-MB-231細胞呈KDR陽性表達，LS174T細胞呈KDR陰性表達。光鏡下見LOVO細胞周圍較多靶向微泡粘附，熒光顯微鏡下LOVO細胞核發(fā)出明亮的藍色熒

20、光，細胞周圍見較多紅色熒光的靶向微泡粘附;光鏡下MDA-MB-231細胞周圍見部分靶向微泡粘附，熒光顯微鏡下MDA-MB-231細胞核發(fā)出明亮的藍色熒光，細胞周圍可見部分紅色靶向微泡粘附;LS174T細胞周圍未見明顯紅色靶向微泡粘附;對照微泡在三組細胞粘附量極少，未見明顯紅色微泡粘附。
　　 3.2.阻斷試驗:普通光鏡下，預(yù)先以K237小肽封閉的LOVO細胞周圍靶向微泡粘附數(shù)量較未封閉組明顯減少，熒光顯微鏡下見LOVO細胞周圍紅

21、色熒光強度明顯減弱。
　　 3.3.統(tǒng)計學分析:三種細胞粘附靶向微泡數(shù)量之間比較有顯著性差異(P=0.000);LOVO細胞周圍粘附的MBp數(shù)目高于MDA-MB-231（19.12±2.83、9.64±2.67，P=0.000）;LOVO細胞周圍粘附的MBp數(shù)目明顯高于LS174T細胞周圍粘附的MBp（19.12±2.83、0.30±0.23，P=0.000）;LOVO細胞周圍粘附的MBp明顯高于MBc（19.12±2.83、0

22、.16±0.15，P=0.000）。小肽預(yù)先封閉后，LOVO周圍細胞靶向微泡粘附數(shù)量與未封閉組靶向微泡的粘附數(shù)量有統(tǒng)計學差異(3.22±2.24、19.12±2.83,P=0.000)。
　　 4.動物體內(nèi)實驗
　　 4.1.動物模型制備:10天后，36只裸鼠均于注射部位形成肉眼可見的實體瘤，瘤體直徑0.4-0.8cm，平均直徑0.6cm，腫塊邊緣不規(guī)則，表皮完好，無破潰出血。
　　 4.2.超聲造影及圖像分析:

23、超聲造影彩色編碼顯示，MDA-MB-231腫瘤組，MBp在腫瘤組織內(nèi)部的彩色編碼圖像顯示腫瘤組織超聲顯影顯著不均勻增強，而MBc在腫瘤組織彩色編碼圖像見輕度超聲顯影，K237小肽封閉后MBp在腫瘤組織彩色編碼圖像見輕度超聲顯影;LS174T組，MBp在腫瘤組織內(nèi)部的彩色編碼圖像顯示腫瘤組織超聲顯影顯著不均勻增強，而MBc在腫瘤組織彩色編碼圖像見輕度超聲顯影，K237小肽封閉后MBp在腫瘤組織彩色編碼圖像見輕度超聲顯影。
　　 4

24、.3.統(tǒng)計學分析:MDA-MB-231腫瘤組，靶向微泡組在腫瘤組織的(Ⅵ)值與對照微泡在腫瘤組織的(Ⅵ)值比較有顯著性差異(38.11±11.75、12.52±5.23，P=0.000)，靶向微泡組聲強度值約為對照微泡組3倍;K237預(yù)先封閉組聲強度值與未封閉組相比有顯著性差異（13.77±4.35、38.11±11.75，P=0.000）。LS174T腫瘤組，靶向微泡組(Ⅵ)值與對照微泡(Ⅵ)值比較有顯著性差異(30.18±9.56、

25、8.28±4.74，P=0.000)，靶向微泡組約為對照組的3.6倍，K237預(yù)先封閉組聲強度值與未封閉組有顯著差異(9.23±3.44、30.18±9.56，P=0.000)。
　　 5.動物體內(nèi)活體熒光成像:兩組荷瘤裸鼠注射熒光標記的MBp后6-10分鐘可在腫瘤部位顯示局部明亮的紅色熒光，注射熒光標記的對照微泡及小肽K237預(yù)先注射封閉30min后再注射熒光標記的靶向微泡，兩種腫瘤部位均未見局部紅色熒光出現(xiàn)。
　　

26、6.免疫組化:免疫組化檢查顯示，MDA-MB-231腫瘤組織內(nèi)部見較多量新生血管，血管內(nèi)皮細胞棕色著色，KDR陽性表達，LS174T腫瘤組織邊緣見新生血管內(nèi)皮細胞棕色著色，KDR陽性表達。
　　 結(jié)論:
　　 1.制備得到的以KDR為靶點的靶向微泡在體外具有與靶細胞結(jié)合的高度特異性。
　　 2.腫瘤靶向顯像效果是通過小肽與腫瘤組織內(nèi)新生血管內(nèi)皮特異性地結(jié)合而促使靶向微泡粘附于腫瘤血管床實現(xiàn)的。
　　 3.