載HSV-TK基因的靶向超聲微泡制備及體外尋靶實驗.pdf

1、第一部分:靶向脂質(zhì)超聲微泡的制備
　　目的:制備一種脂質(zhì)超聲微泡作為載體，使其粒徑為納米級，并實現(xiàn)其與肝癌細(xì)胞特異性抗體的偶聯(lián)。
　　方法:1.將DPPA、Bio-DSPE按一定摩爾比溶解于有機(jī)溶液中，待有機(jī)溶液揮發(fā)后，形成白色粉末樣物質(zhì)，取出一定量的混合物，加入甘油、PBS緩沖液，45℃水浴后注入C3F8氣體采用機(jī)械震蕩法即可制備出超聲微泡。將制備好的超聲微泡光鏡下觀察其形態(tài)，粒徑儀測定其粒徑大小及表面所帶zata電位。<

2、br>　　2.將制備出的超聲微泡通過生物素-親和素系統(tǒng)實現(xiàn)其與抗體的偶聯(lián)，即在已制備的超聲微泡中加入過量的鏈霉親和素，再加入生物素化GPC3單克隆抗體即可。加入FITC標(biāo)記的二抗在激光共聚焦顯微鏡下觀察靶向微泡的形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測標(biāo)記上抗體的微泡比率。
　　結(jié)果:1.制備出的超聲微泡成圓形，大小較均一，平均粒徑在528nm左右，所帶平均電荷為-22mv。2.靶向超聲微泡在免疫熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下觀察，于藍(lán)光激發(fā)波下可見

3、微泡中心為黑色，周圍有一圈綠色的熒光，表明GPC3單克隆抗體已經(jīng)特異性結(jié)合于微泡表面，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測約85％的超聲微泡標(biāo)記上抗體。
　　結(jié)論:1.制備出的超聲微泡呈圓形、大小較均一，穩(wěn)定性較好，其粒徑為納米級，滿足本次實驗要求。2.通過生物素-親和素系統(tǒng)實現(xiàn)了超聲微泡與GPC3單克隆抗體的偶聯(lián)，為靶向識別及后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。
　　第二部分肝癌細(xì)胞體外尋靶實驗
　　目的:實現(xiàn)連接有GPC3單克隆抗體的超聲微泡（即靶向超

4、聲微泡）與人肝癌HepG2細(xì)胞特異性結(jié)合。
　　方法:1.分別培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞株、人肝臟L02細(xì)胞株，細(xì)胞免疫組化實驗，檢測證實肝細(xì)胞型肝癌(HCC)細(xì)胞膜表面有特異性GPC3抗原的表達(dá)。
　　2.將人肝癌HepG2細(xì)胞株、人正常肝臟L02細(xì)胞株、人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7經(jīng)DiI染色，于激光共聚焦培養(yǎng)皿中加入經(jīng)FITC標(biāo)記二抗后的靶向超聲微泡，待其充分結(jié)合后通過激光共聚焦顯微鏡檢測其靶向性。
　　結(jié)果:1.人肝

5、癌細(xì)胞膜表面有抗GPC3特異性抗原表達(dá)，而正常肝臟L02細(xì)胞表面并沒有表達(dá)。2.靶向超聲微泡能特異性結(jié)合于人HepG2細(xì)胞膜表面，正常肝臟L02細(xì)胞及人乳腺癌細(xì)胞膜表面并沒有超聲微泡的聚集。
　　結(jié)論:所制備的靶向超聲微泡在體外研究中可實現(xiàn)特異性識別HepG2細(xì)胞作用，為進(jìn)一步體內(nèi)試驗夯實了基礎(chǔ)。
　　第三部分載HSV-TK基因靶向超聲微泡的制備
　　目的:制備一種同時鏈接有GPC3單克隆抗體和HSV-TK基因的超聲微

6、泡。
　　方法:1.將多聚賴氨酸與HSV-TK基因按一定比例混合反應(yīng)后再加入一定量的超聲微泡，實現(xiàn)微泡和HSV-TK基因的結(jié)合，加入PI標(biāo)記質(zhì)粒在激光共聚焦顯微鏡下觀察載基因微泡的形態(tài)。
　　2.在靶向超聲微泡的基礎(chǔ)上鏈接HSV-TK基因，制備載HSV-TK基因的靶向超聲微泡，并在激光共聚焦顯微鏡下觀察靶向微泡的形態(tài)。
　　結(jié)果:1.載HSV-TK基因超聲微泡經(jīng)PI標(biāo)記后在激光共聚焦顯微鏡下觀察，于綠光激發(fā)波下可見微泡

7、中心為黑色，周圍有一圈紅色的熒光，即表明HSV-TK基因已經(jīng)特異性結(jié)合于微泡表面。2.經(jīng)標(biāo)記的載HSV-TK自殺基因的靶向超聲微泡在激光共聚焦顯微鏡下觀察，可見在藍(lán)光激發(fā)波下微泡周圍有一圈綠色的熒光，在綠光激發(fā)波下微泡周圍有一圈紅色的熒光，激光共聚焦處理下綠色熒光和紅色熒光完全重合，形成黃色熒光，微泡表面同時鏈接有GPC3抗體和HSV-TK自殺基因。
　　結(jié)論:成功制備了載HSV-TK自殺基因的靶向超聲微泡，為進(jìn)一步完成體外基因轉(zhuǎn)