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文檔簡介
1、第一部分靶向超聲微泡MBICAM-1的制備及體內(nèi)顯影實驗
目的:制備靶向超聲微泡MBICAM-1,鑒定所制備微泡的基本性質(zhì),并進行大鼠肝臟顯影實驗。
方法:利用磷脂混懸液制備普通脂質(zhì)微泡MB以及生物素化脂質(zhì)微泡MBbiotin;通過“生物素-親和素”橋接法把抗ICAM-1單抗結(jié)合到生物素化脂質(zhì)微泡MBbiotin表面,制備成靶向超聲微泡MBICAM-1;分別檢測所制備微泡的濃度及粒徑,并在顯微鏡下觀察微泡的形態(tài);熒光
2、免疫染色法驗證抗ICAM-1單抗與微泡的結(jié)合;流式細胞儀檢測微泡與抗ICAM-1單抗的結(jié)合率;將制備的微泡對大鼠肝臟進行超聲造影(CEUS,contrast-enhanced ultrasonography)對比分析微泡的顯影效果。
結(jié)果:利用磷脂混懸液制備的普通脂質(zhì)微泡MB平均粒徑為1.57μm,濃度為1.0×109/mL;生物素化脂質(zhì)微泡MBbiotin平均粒徑為1.09μm,濃度為2.3×1010/mL;“生物素-親和素
3、”橋接法制備的靶向超聲微泡MBICAM-1平均粒徑為2.28μm,濃度為2.4×108/mL;顯微鏡下可見三種微泡的形態(tài)完整、規(guī)則,分布較均勻;熒光素FITC標記的靶向超聲微泡MBICAM-1在熒光顯微鏡下表達綠色熒光;流式細胞儀檢測到微泡和抗ICAM-1單抗的平均結(jié)合率為(86.5±5.3)%;制備的微泡在大鼠肝臟造影中均呈高增強,與聲諾維效果相似。
結(jié)論:利用磷脂混懸液成功制備了普通脂質(zhì)微泡MB和生物素化脂質(zhì)微泡MBbio
4、tin;通過“生物素-親和素”橋接法成功制備了靶向超聲微泡MBICAM-1;制備的各種微泡在大鼠肝臟內(nèi)呈高增強,與聲諾維效果相似。
第二部分靶向超聲微泡MBICAM-1的靶向?qū)嶒炑芯?br> 目的:研究靶向超聲微泡MBICAM-1在體外及體內(nèi)的靶向能力。
方法:構(gòu)建ICAM-1質(zhì)粒,對其進行擴增、提取后,檢測提取質(zhì)粒的濃度、進行酶切電泳并對構(gòu)建的ICAM-1質(zhì)粒進行測序;體外培養(yǎng)Hela細胞,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將ICAM
5、-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hela細胞,使Hela細胞表達ICAM-1表面抗原,熒光顯微鏡下觀察Hela細胞的ICAM-1表面抗原表達情況;顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染成功后的Hela細胞與靶向超聲微泡MBICAM-1的結(jié)合情況。通過對6只家兔的左側(cè)跟腱注射Ⅰ型膠原酶制造跟腱炎癥模型,右側(cè)跟腱注射等量生理鹽水作為對照組,每天觀察家兔雙側(cè)跟腱表面有無紅腫以及家兔的行走步態(tài);10天后超聲觀察家兔雙側(cè)跟腱,并用第一部分制備的三種微泡對雙側(cè)跟腱進行超聲造影檢查,觀察對
6、比雙側(cè)跟腱超聲造影增強情況;取雙側(cè)跟腱標本進行蘇木素-伊紅(H-E)染色、免疫組化法觀察雙側(cè)跟腱病理情況。
結(jié)果:ICAM-1質(zhì)粒的酶切電泳以及測序正確,提取到的ICAM-1質(zhì)粒濃度為592.8ng/μL;熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染后的Hela細胞表達綠色熒光;顯微鏡下可見到靶向超聲微泡MBICAM-1與轉(zhuǎn)染后的Hela細胞結(jié)合,靶向超聲微泡MBICAM-1環(huán)繞在Hela細胞周圍。家兔造模后,左側(cè)跟腱出現(xiàn)紅腫以及左下肢跛行,右側(cè)跟腱
7、未見明顯異常;造模10天后進行超聲檢查,家兔左側(cè)跟腱內(nèi)部回聲不均,左側(cè)跟腱厚約2.23±0.15mm,右側(cè)跟腱回聲尚均勻,右側(cè)跟腱厚度約1.77±0.08mm;超聲造影觀察:普通脂質(zhì)微泡MB、生物素化脂質(zhì)微泡MBbiotin對家兔雙側(cè)跟腱造影均呈微弱增強,靶向超聲微泡MBICAM-1對家兔右側(cè)跟腱造影呈微弱增強,對左側(cè)跟腱造影呈高增強;跟腱病理顯示左側(cè)跟腱新生血管增多,膠原纖維排列疏松、紊亂,左側(cè)跟腱表達ICAM-1表面抗原細胞數(shù)目達3
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