超聲聯(lián)合微泡促HGF修飾BMSCs靶向歸巢抗腎纖維化的實驗研究.pdf

1、研究背景:
　　腎小管間質(zhì)纖維化是大多數(shù)慢性腎病的終末期表現(xiàn),因此及早控制和逆轉(zhuǎn)腎臟纖維化的進(jìn)程是慢性腎臟疾病治療中非常重要的治療途徑。
　　研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)由于其高可塑,易分化等特性,在組織修復(fù)和器官再生的細(xì)胞治療和基因治療等領(lǐng)域表現(xiàn)出特有的優(yōu)勢。對于腎臟而言,骨髓干細(xì)胞可以分化為腎臟細(xì)胞包括系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞等,這就使得BMSCs成為修復(fù)受損腎臟最具吸引力的細(xì)胞。BMSCs還

2、可以通過旁分泌的形式對局部缺血或再灌流造成的腎損傷進(jìn)行保護(hù),明顯減少鄰近細(xì)胞的壞死。然而,也有研究報道單純BMSCs移植治療受損的纖維化改變的腎臟效果不佳,究其原因可能與BMSCs的移植途徑,靶向歸巢數(shù)量少以及缺乏能夠明顯改善腎間質(zhì)纖維化的肝細(xì)胞生長因子(HGF)等多方面因素有關(guān)。
　　近年來,超聲造影劑(微泡)的應(yīng)用已從診斷領(lǐng)域向治療領(lǐng)域拓展。微泡借助其在超聲作用下的空化作用可以作為一種基因治療的非病毒載體。超聲靶向擊破微泡(U

3、ltrasound-targetedmicrobubbledestruction,UTMD)介導(dǎo)藥物靶向傳輸和基因轉(zhuǎn)染是近年發(fā)展起來并被公認(rèn)為有效而且很有潛力的方法。該研究設(shè)想以此特性用HGF修飾BMSCs,通過對基因轉(zhuǎn)染后的BMSCs生物學(xué)功能評價優(yōu)選聲學(xué)參數(shù),獲得活性顯著提高的目的細(xì)胞對腎纖維化動物模型進(jìn)行移植。另外,UTMD還可能改變靶器官的微環(huán)境,增強(qiáng)靶器官微血管通透性,使內(nèi)皮細(xì)胞間隙增加,促使細(xì)胞因子分泌的改變,為BMSCs“

4、著床”于靶組織創(chuàng)造條件。通過超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)HGF修飾BMSCs移植,促進(jìn)HGF-BMSCs向損傷腎臟選擇性歸巢與聚集,進(jìn)而起到提高療效和改善腎纖維化的作用。將基因治療和細(xì)胞治療相結(jié)合,提高移植效率,對于抗腎纖維化的可行性、安全性及靶向性進(jìn)行研究,并對其機(jī)制進(jìn)行探討。
　　研究目的:
　　1.探討微泡介導(dǎo)治療超聲聯(lián)合聚乙烯亞胺(PEI)實現(xiàn)HGF修飾BMSCs的有效性,可行性及其機(jī)制。試圖探索一種非病毒的方法來實現(xiàn)BMSCs

5、的高效轉(zhuǎn)染從而避免病毒轉(zhuǎn)染將會引發(fā)的安全問題;
　　2.探討一定參數(shù)配比條件下的診斷超聲聯(lián)合微泡對于大鼠腎間質(zhì)毛細(xì)血管通透性的改變情況以及對于腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的影響;
　　3.探討診斷超聲聯(lián)合微泡作用下靜脈移植BMSCs促進(jìn)其歸巢單側(cè)輸尿管梗阻模型受損腎臟的可行性及其機(jī)制;
　　4.探討診斷超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)BMSCs和HGF修飾的BMSCs移植應(yīng)用于延緩大鼠腎纖維化進(jìn)程的有效性、可行性、安全性及可能機(jī)制,為探討腎纖維

6、化新的治療手段提供實驗基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1.微泡介導(dǎo)治療超聲聯(lián)合PEI轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外研究
　　采用貼壁培養(yǎng)法對大鼠BMSCs進(jìn)行分離培養(yǎng)。并通過生長曲線、細(xì)胞周期、透射電鏡等檢測其生物學(xué)特性。用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記分子并成脂、成骨誘導(dǎo)分化進(jìn)行細(xì)胞鑒定。構(gòu)建質(zhì)粒DNA:pEGFP-HGF。按照均勻?qū)嶒炘O(shè)計,對超聲強(qiáng)度,微泡濃度,超聲輻照時間三個主要影響因素進(jìn)行考察,通過對細(xì)胞密度,轉(zhuǎn)染效率

7、,細(xì)胞存活率的檢測,最終優(yōu)選出最佳的轉(zhuǎn)染參數(shù)配比。對轉(zhuǎn)染后BMSCs的細(xì)胞周期,分化能力進(jìn)行檢測。運用激光共聚焦熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)染后48h,7d的BMSCs熒光表達(dá)進(jìn)行觀察。掃描電鏡觀察超聲聯(lián)合微泡作用對于細(xì)胞造成的損傷以及細(xì)胞的自行恢復(fù)情況。
　　2.微泡介導(dǎo)診斷超聲對健康大鼠腎臟通透性的影響及安全性研究
　　診斷超聲聯(lián)合微泡作用采用不同的超聲發(fā)射方式(連續(xù)式超聲輻照,間歇式超聲輻照)于健康大鼠腎臟。采用Evansblue(

8、EB)定量分析,HE染色,透射電鏡對靶器官腎臟間質(zhì)區(qū)毛細(xì)血管通透性的改變進(jìn)行觀察檢測;通過激光共聚焦熒光顯微鏡對DIO標(biāo)記微泡的靶器官釋放的定位及相對定量進(jìn)行觀察分析;對尿蛋白進(jìn)行檢測,評價該方法對腎小球濾過、腎小管重吸收的影響。
　　3.診斷超聲聯(lián)合微泡促進(jìn)BMSCs歸巢模型大鼠腎臟的研究
　　構(gòu)建單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型,采用影像學(xué)和病理學(xué)方法評價模型的建立。于建模后7d,采用超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)HGF-BMSCs靜脈移

9、植。分組:模型大鼠移植HGF-BMSCs組(UM組);模型大鼠+超聲+微泡+HGF-BMSCs組(UUM組),健康大鼠移植HGF-BMSCs組(CM組);健康大鼠+超聲+微泡+HGF-BMSCs組(CUM組)。激光共聚焦觀察示蹤各組腎臟的綠色熒光陽性細(xì)胞計數(shù)和統(tǒng)計學(xué)分析。HE染色和透射電鏡觀察各組移植后靶組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和間質(zhì)毛細(xì)血管超微結(jié)構(gòu)。免疫組化對受損腎臟歸巢相關(guān)因子SDF-1表達(dá)進(jìn)行定量分析。
　　4.診斷超聲聯(lián)合微泡經(jīng)靜脈移

10、植BMSCs改善大鼠腎纖維化的研究
　　構(gòu)建單側(cè)輸尿管梗阻再通(RUUO)模型,采用影像學(xué)和病理學(xué)方法評價模型的建立。建模后7d進(jìn)行干細(xì)胞移植治療,于14d解除輸尿管梗阻。在建模后7d,14d,21d,28d四個時相點分別對RUUO組,BMSCs組,US+MB+BMSCs組和US+MB+HGF-BMSCs組進(jìn)行觀察。采用影像學(xué)方法對腎臟形態(tài)進(jìn)行觀察;HE染色,Masson染色對腎小管間質(zhì)損害進(jìn)行觀察和病理評分;RealtimePC

11、R檢測肝細(xì)胞生長因子(HGF),轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達(dá);免疫組織化學(xué)檢測α-SMA表達(dá);westernblot檢測SDF-1,α-SMA表達(dá)。生化檢測血清肌酐,血清尿素氮和內(nèi)生肌酐清除率評價腎臟功能改變。
　　結(jié)果:
　　1.微泡介導(dǎo)治療超聲聯(lián)合PEI轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外研究
　　成功分離培養(yǎng)BMSCs,檢測結(jié)果顯示絕大部分細(xì)胞表達(dá)CD44,CD29和CD90,幾

12、乎不表達(dá)CD34,CD45和CD11b。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后油紅O染色胞漿脂滴形成,成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)形成。超聲聯(lián)合微泡協(xié)同PEI轉(zhuǎn)染BMSCs最佳參數(shù):聲強(qiáng)(Q)=0.6W/cm2,微泡(MB)=106/ml,輻照時間(T)=30s時,pEGFP-HGF轉(zhuǎn)染效率38.81±2.58％和BMSCs細(xì)胞存活率82.10±1.77%達(dá)到一個相對比較匹配的數(shù)值。不同影響因素比較PEI:DNA+MB+US組同其他各組有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05

13、),激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后直到7d仍可見綠色熒光蛋白表達(dá)。轉(zhuǎn)染后7d,PEI:DNA+MB+US組的轉(zhuǎn)染效率為57.43±1.56%(圖12F),而細(xì)胞活性下降到78.98±3.11%。轉(zhuǎn)染后的BMSCs細(xì)胞周期及分化能力檢測G1期的細(xì)胞占82.93%,成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后油紅O染色胞漿脂滴形成,成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)形成。Westernblot檢測細(xì)胞中HGF蛋白的表達(dá):轉(zhuǎn)染pEGFP-HGF成功表達(dá)HGF蛋白,而對應(yīng)的空白對照組和轉(zhuǎn)

14、染pEGFP-N1組未檢測到目的蛋白。掃描電鏡觀察到超聲聯(lián)合微泡最佳條件作用后,BMSCs的細(xì)胞膜上可以看到微小的孔,大小不一,形態(tài)各異。7天后,BMSCs基本恢復(fù),大多數(shù)的微孔已經(jīng)消失,細(xì)胞表面基本光滑。
　　2.微泡介導(dǎo)診斷對大鼠腎臟通透性的影響及安全性
　　Evansblue定量分析連續(xù)式超聲輻照組(CUS)和間歇式超聲輻照組(IUS)同對照組比較沒有明顯差異(P<0.05)。超聲聯(lián)合微泡作用(UTMD)后,無論CUS

15、+MB組還是IUS+MB組的EB含量同其它三組比較都呈現(xiàn)顯著增加,組間差異顯著(P<0.05)。UTMD后6小時,在IUS+MB6h組EB含量達(dá)到3.15±2.20μg/g,同IUS+MB組相比較,下降顯著。UTMD后24小時,IUS+MB24h組EB含量達(dá)到0.690±0.540μg/g,這與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。病理學(xué)檢測提示UTMD后間質(zhì)受損,可見紅細(xì)胞的漏出,腎間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管連續(xù)性中斷,腎小球未受到明顯損傷。而

16、腎間質(zhì)的損傷在24h內(nèi)能夠自身恢復(fù)。激光共聚焦掃描熒光顯微鏡觀察到DIO標(biāo)記的MB在腎間質(zhì)靶向釋放,同其它臟器比較具有顯著差異。其中IUS+MB組(IOD=2092.17±342.36)和CUS+MB組(IOD=943.48±179.07)同對照組和右腎比較顯著增加,有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。IUS+MB組同CUS+MB組相比較,呈現(xiàn)出顯著的增加(P<0.05)。尿檢結(jié)果顯示各組的尿蛋白水平在正常范圍內(nèi)(-)到(++),均未觀察到蛋

17、白尿的顯著變化。
　　3.診斷超聲聯(lián)合微泡促進(jìn)BMSCs歸巢模型大鼠腎臟的研究
　　成功構(gòu)建UUO模型。激光共聚焦觀察示蹤靜脈移植BMSCs歸巢梗阻側(cè)腎臟,在健康大鼠移植HGF-BMSCs組(CM組)和健康大鼠+超聲+微泡+HGF-BMSCs組(CUM組)的腎臟組織切片上沒有觀察到綠色熒光表達(dá);而在模型大鼠移植HGF-BMSCs組(UM組)和模型大鼠+超聲+微泡+HGF-BMSCs組(UUM組)腎小管間質(zhì)區(qū)內(nèi)觀察到胞漿內(nèi)表達(dá)

18、綠色熒光的細(xì)胞,分別為(16.41±5.37)個、(86.39±8.49)個,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。HE染色光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)UTMD作用后的模型大鼠腎間質(zhì)的毛細(xì)血管破裂,大量紅細(xì)胞漏出,間質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松,水腫,腎間質(zhì)通透性顯著增加。透射電鏡顯示了類似的結(jié)果。免疫組織化學(xué)檢測歸巢相關(guān)因子SDF-1,CM組和CUM組SDF-1表達(dá)定位遠(yuǎn)曲小管和極少近曲小管的胞漿中,UM組和UUM組定位在大部分的腎小管上皮細(xì)胞胞漿中,甚至在個別細(xì)胞的膜

19、上也有表達(dá)。UUM組(22146.49±1920.73)高于UM組(18643.94±2046.29),差異不顯著,P>0.05,與CUM組(5528.36±1021.81),CM組(5162.38±1376.54)的組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P<0.05。
　　4.診斷超聲聯(lián)合微泡經(jīng)靜脈移植BMSCs改善大鼠腎纖維化的研究
　　成功構(gòu)建RUUO模型。超聲觀察各組腎臟在不同時相點(建模后7d,14d,21d,28d)的形態(tài)變化,

20、US+MB+BMSCs組和US+MB+HGF-BMSCs組同RUUO組和BMSCs組比較差異顯著。腎小管間質(zhì)病變的病理積分發(fā)現(xiàn)在術(shù)后21d和28dUS+MB+BMSCs組和US+MB+HGF-BMSC組的病理積分開始明顯低于BMSCs組和RUUO組(P<0.05)。其中28d時US+MB+HGF-BMSC組較其他三組差異顯著(P<0.05)。Real-timePCR檢測不同時相點各組腎臟組織致纖維化轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β的基因表達(dá):14

21、d后移植BMSCs的三個治療組與RUUO組比較,差異顯著(P<0.05);診斷超聲聯(lián)合微泡作用的兩個BMSCs移植治療組表達(dá)減低,較單純BMSCs移植組差異顯著(P<0.05);在14d和21d兩時相點,US+MB+HGF-BMSCs組與US+MB+BMSCs組比較,差異顯著(P<0.05)。肝細(xì)胞生長因子(HGF)的基因表達(dá):在14d和28d兩個時相點,US+MB+BMSCs組和US+MB+HGF-BMSCs組的HGF表達(dá)較RUUO組