超聲輻照破壞微泡對(duì)心肌微環(huán)境的影響及促犬MSCs歸巢缺血心肌實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文分析了超聲輻照破壞微泡對(duì)心肌微環(huán)境的影響，對(duì)促犬MSCs歸巢缺血心肌進(jìn)行了研究。本研究分為四個(gè)部分：
　　 第一部分：
　　 目的：探討出一種可靠、純度高的犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)體外提取分離、純化、培養(yǎng)和鑒定的方法。
　　 方法：采用骨髓穿刺、Percoll密度梯度離心法分離出犬骨髓單個(gè)核細(xì)胞,結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲得純度高的骨髓間充質(zhì)

2、干細(xì)胞,應(yīng)用細(xì)胞免疫化學(xué)和流式細(xì)胞儀對(duì)BMMSCs表面標(biāo)記蛋白進(jìn)行細(xì)胞鑒定和周期測(cè)定。
　　 結(jié)果：分離出的細(xì)胞檢測(cè)顯示CD29、CD44均呈陽(yáng)性表達(dá),CD31、CD34、CD45和vWF的表達(dá)為陰性；88.88％的細(xì)胞處在G0/G0期；2w內(nèi)經(jīng)3代培養(yǎng)即可擴(kuò)增到107細(xì)胞數(shù)量級(jí)。
　　 結(jié)論：采用密度為1.073g/ml Percoll分離液梯度離心,并用貼壁純化的方法可獲得純度較高的BMMSCs。2w內(nèi)經(jīng)3代培養(yǎng)即可

3、擴(kuò)增到107細(xì)胞數(shù)量級(jí),符合構(gòu)建組織工程種子細(xì)胞的要求。
　　 第二部分：
　　 目的：探討不同強(qiáng)度的超聲輻照破壞微泡對(duì)犬心肌組織的生物學(xué)效應(yīng)。
　　 方法：9只健康成年雜種犬隨機(jī)分成3組,每組3只。采用頻率為1 MHz,強(qiáng)度不同的超聲輻照犬心肌組織,輻照時(shí)間為5 min,同時(shí)靜脈輸入2 ml(濃度為2×108個(gè)/ml)微泡造影劑。輻照完畢后即刻處死動(dòng)物,取局部心肌組織,進(jìn)行HE染色和透射電鏡觀察心肌細(xì)胞及毛細(xì)血

4、管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 結(jié)果：0.5W/cm2超聲破壞微泡后心肌組織水腫,無(wú)出血；1.0W/cm2超聲破壞微泡后心肌組織輕微出血和少量炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)；2.0W/cm2超破壞微泡后心肌組織明顯出血和一定程度的炎癥細(xì)胞侵潤(rùn)。
　　 結(jié)論：不同強(qiáng)度超聲破壞微泡造影劑能使犬心肌組織產(chǎn)生不同程度的生物學(xué)效應(yīng),發(fā)現(xiàn)超聲強(qiáng)度在1.0～2.0 W/cm2時(shí)能使心肌損傷程度在不重的情況下引起一定程度的炎癥反應(yīng)。
　　

5、第三部分：
　　 目的：探討超聲輻照破壞微泡對(duì)心肌梗死模型犬局部心肌微環(huán)境的影響情況。
　　 方法：10只心肌梗死模型犬隨機(jī)分成兩組(實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組),每組5只。在心肌梗死模型建立1w后,實(shí)驗(yàn)組用聲強(qiáng)為1.0 W/cm2,頻率為1 MHz的脈沖超聲經(jīng)胸輻照左室前壁,輻照10 min,同時(shí)靜脈輸注2 ml(濃度2×108個(gè)/m1)微泡造影劑,每2-3 d輻照一次,一共處理3次；對(duì)照組不經(jīng)任何處理。在心肌梗死模型建立14-1

6、7 d后處死所有動(dòng)物,在心肌梗死邊緣區(qū)取局部心肌組織,通過(guò)Western blot、定量實(shí)時(shí)PCR及免疫組織化學(xué)檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelialgrowth factor VEGF),基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(Stromal cell-derivedfactor-1,SDF-1),血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附因子1(vascular cell adheremolecular-1,VCAM-1),白介素1β(Interleuk

7、in1,IL-1β)的表達(dá)水平,觀察超聲輻照破壞微泡對(duì)心肌微環(huán)境的影響。
　　 結(jié)果：Western blot和免疫組織化學(xué)檢查顯示實(shí)驗(yàn)組心肌分泌VEGF,SDF-1,VCAM-1,IL-1β比對(duì)照組多,定量實(shí)時(shí)PCR檢查到實(shí)驗(yàn)組內(nèi)VEGF,SDF-1,VCAM-1,IL-1β表達(dá)明顯比對(duì)照組多(P<0.05)。
　　 結(jié)論：超聲輻照破壞微泡可以引起心肌內(nèi)源性生物活性物質(zhì)的分泌,能促進(jìn)VEGF,SDF-1,VCAM-1和

8、IL-1β分泌,改變了局部心肌微環(huán)境。
　　 第四部分：
　　 目的：觀察超聲輻照微泡對(duì)犬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstem cells,MSCs)歸巢到犬心肌缺血部位的作用。
　　 方法：10只心肌梗死模型犬隨機(jī)分成兩組(實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組),每組5只。在心肌梗死模型建立1w后,實(shí)驗(yàn)組用聲強(qiáng)為1.0 W/cm2,頻率為1 MHz的脈沖超聲經(jīng)胸輻照心肌,輻照10 min,同時(shí)靜脈輸注2ml(濃度為2×1

9、08個(gè)/ml)微泡造影劑,每2-3 d處理一次,一共處理3次；對(duì)照組不經(jīng)任何處理。在心梗后2w,實(shí)驗(yàn)組經(jīng)冠狀動(dòng)脈輸注5ml(濃度1.35×106個(gè)/ml),DAPI標(biāo)記的MSCs。對(duì)照組輸注等量的干細(xì)胞。移植5 d后處死動(dòng)物,取心肌梗死邊緣區(qū)組織,用激光共聚焦顯微鏡觀察MSCs在心肌缺血區(qū)的分布情況。
　　 結(jié)果：通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組MSCs(66.8±5.03/HPF),明顯比對(duì)照組MSCs(14.6±3.76/H