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1、背景:最近幾年的研究證明超聲聯(lián)合內(nèi)含全氟顯氣體的普通脂質(zhì)微泡造影劑可以增效干細(xì)胞移植治療心肌梗死,微泡效應(yīng)帶來(lái)局部心肌組織內(nèi)基質(zhì)衍生因子-1(SDF-1)表達(dá)增加是可能機(jī)制之一。一氧化氮(N0)是人體重要的第二信使,在心血管系統(tǒng)中有著極為重要的作用。研制新型NO微泡,并應(yīng)用超聲聯(lián)合新型NO微泡介導(dǎo)干細(xì)胞移植,理論上將會(huì)有更好的效果。
目的:(1)探討超聲聯(lián)合NO微泡作用于大鼠心肌組織后局部產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng);(2)探討超聲聯(lián)合N
2、O微泡用于干細(xì)胞移植的可行性及優(yōu)勢(shì)。
方法:(1)將磷脂酰膽堿與二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺按照95∶5的比例溶解于氯仿中,后將混合液置于真空蒸發(fā)器中除去氯仿,留取結(jié)晶物,加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)調(diào)整溶液濃度為1 mg/ml,將上述溶液置于60℃水浴中震蕩,形成脂質(zhì)懸液,在厭氧條件下,將上述脂質(zhì)懸液置于100W的聲強(qiáng)下進(jìn)行連續(xù)處理,時(shí)間為5分鐘,同時(shí)以4ml/min的流速供給NO氣
3、體。(2)將32只SPF級(jí)SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組,每組8只。第一、二、三組分別經(jīng)尾靜脈輸入1ml的NO微泡、普通脂質(zhì)微泡以及PBS,采用干預(yù)頻率為1MHz、強(qiáng)度為1W/cm2的超聲輻照大鼠心前區(qū),輻照時(shí)間為10分鐘;第四組為空白對(duì)照組。4小時(shí)后每組處死4只大鼠,留取心肌組織進(jìn)行HE染色,觀察局部的炎癥反應(yīng)情況及心肌組織結(jié)構(gòu)變化;同時(shí)留取血清標(biāo)本用于檢測(cè)肌酸激酶(CK),乳酸脫氫酶(LDH)和肌鈣蛋白Ⅰ(TnⅠ)的含量。1周后,處死剩余
4、大鼠,取心肌組織進(jìn)行RT-PCR和Western blot分別檢測(cè)SDF-1的基因及蛋白相對(duì)表達(dá)量。(3)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的分離培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記:密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BMSCs;形態(tài)學(xué)觀察及流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD44、CD29、CD34及CD45進(jìn)行BMSCs鑒定;CM-Dil體外標(biāo)記BMSCs,熒光顯微鏡觀察標(biāo)記效率。(4)大鼠心肌梗死模型的制備
5、與評(píng)價(jià):采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立大鼠心肌梗死模型,以心電圖表現(xiàn)及病理學(xué)方法評(píng)價(jià)模型制備成功與否。(5)超聲聯(lián)合NO微泡介導(dǎo)干細(xì)胞移植:將42只成功建立心肌梗死模型的大鼠隨機(jī)分為4組:第一組(US+NOMB+BMSCs組,n=12)經(jīng)尾靜脈輸入NO微泡造影劑1ml(微泡濃度為1*108個(gè)/ml),并使用頻率為1MHz,強(qiáng)度為1W/cm2的超聲輻照大鼠心前區(qū),輻照時(shí)間為10分鐘,隨后將CM-Dil標(biāo)記好的BMSCs約1x107細(xì)胞量用2
6、ml的PBS稀釋后經(jīng)尾靜脈緩慢注射。第二組(US+MB+BMSCs組,n=10)將NO更換為普通脂質(zhì)微泡,余下處理同第一組。第三組(BMSCs組,n=10)將CM-Dil標(biāo)記好的BMSCs約1×107細(xì)胞量用2mL的PBS稀釋后經(jīng)尾靜脈緩慢注射,余不做處理。第四組(CK組,n=10)直接經(jīng)尾靜脈注射2ml的PBS。干預(yù)后48h處死所有大鼠,取心肌梗死區(qū)心肌組織作冰凍切片,在激光共聚焦顯微鏡下計(jì)數(shù)比較各組缺血心肌內(nèi)熒光標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),以熒
7、光強(qiáng)度代表相對(duì)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
結(jié)果:(1)NO微泡平均直徑為3.85μm,其中NO的有效濃度約為1.33×10-9mmol/微泡,NO微泡濃度為6-8×108/mL。(2)輻照4小時(shí)后留取心肌組織行HE染色顯示各組均可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)明顯組織損傷,各組間沒有明顯差異;血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)顯示四組CK分別為1791±125.0、1942±86.4、1342±90.9、1193.5±92.1,LDH分別為843±69.3、936±
8、142.7、637±85.2、564±85.6,TnⅠ分別為596.676±53.046、864.983±79.006、339.581±60.097、274.579±40.738,第一組與第二組血清CK和LDH高于第三組和第四組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);第一組血清TnⅠ低于第二組,但高于第三組和第四組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻照1周后留取的心肌組織行RT-PCR(0.70±0.018、0.65±0.026、0.
9、23±0.024、0.02±0.010)和Western blot(0.89±0.024、0.78±0.017、0.49±0.024、0.22±0.022)分析結(jié)果均顯示第一組SDF-1相對(duì)表達(dá)量最多,各組間進(jìn)行兩兩比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(3)通過(guò)密度梯度離心法分離培養(yǎng)的BMSCs貼壁生長(zhǎng),形態(tài)以梭形為主,較為均一。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞表面CD44(99.34%)及CD29(99.35%)呈高表達(dá),幾乎不表達(dá)C
10、D34(1.47%)及CD45(1.56%)。熒光顯微鏡觀察顯示經(jīng)CM-Dil標(biāo)記的BMSCs細(xì)胞膜呈均勻明亮的紅色,陽(yáng)性率在98%以上。(4)通過(guò)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法建立心肌梗死模型后,梗死遠(yuǎn)端局部心肌組織蒼白,運(yùn)動(dòng)幅度減弱,心電圖表現(xiàn)為ST段改變、病理性Q波等動(dòng)態(tài)變化。(5)激光共聚焦顯微鏡觀察計(jì)數(shù)各組心肌缺血區(qū)CM-Dil陽(yáng)性BMSCs,結(jié)果顯示:US+NOMB+BMSCs組3140.2±317.1、US+MB+BMSCs組
11、2408.9±276.3、BMSCs組1084.1±241.7及空白對(duì)照組617.5±209.3,第一組與其他三組分別做兩兩比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
結(jié)論:(1) NO微泡制備成功,具有較好的穩(wěn)定性,大小均一,分散好,符合一般微泡造影劑的要求。(2)一定的超聲干預(yù)參數(shù)條件下,超聲聯(lián)合NO微泡輻照對(duì)大鼠心肌組織無(wú)明顯破壞作用,且能增加局部SDF-1的表達(dá)。(3)密度梯度離心法可成功分離培養(yǎng)出大鼠BMSCs,CM
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