燒傷后一氧化氮促進表皮干細胞遷移的作用及機制研究.pdf

1、本課題重點探討了NO通過cGMP\PKG\Rho GTPase途徑調節(jié)表皮干細胞骨架的重排，進而促進ESCs遷移;以及在體NO通過增強表皮干細胞遷移而促進創(chuàng)面再上皮化，最終修復創(chuàng)面。
　　一、燒傷后創(chuàng)面NO的產生:為進一步了解燒傷患者創(chuàng)面中NO濃度及燒傷不同時間點NO濃度的變化，共收集臨床20例燒傷患者標本，其中水泡液46份，血清27份;深二度燒傷創(chuàng)面組織14份，同體正常皮膚組織14份。均符合入選標準:年齡18-55，性別不限，燒

2、傷面積≤40％TBSA。收集水泡液、血清及組織塊-80度保存。
　　1、水泡液及血清中NO濃度檢測:采用Griess Reagent法檢測發(fā)現，小面積(燒傷面積≤40％TBSA)患者血漿中NO的濃度相對恒定在6.44±0.71μM;而燒傷患者水泡液中NO隨傷后不同時間而有較大變化，傷后10小時內的水泡液NO濃度為7.73±0.62μM，傷后10至20小時水泡液NO濃度為9.45±0.65μM，傷后20至30小時水泡液NO濃度為7.

3、23±1.53μM，傷后30小時以上時水泡液NO濃度為6.84±1.08μM，發(fā)現在傷后10至20小時時水泡液NO濃度最高。
　　2、燒傷創(chuàng)面中NO濃度的測定:組織塊碾磨后用同體積去離子水混合離心取上清。結果發(fā)現:正常組織中NO濃度為0.32±0.13μM，淺二度創(chuàng)面組織中NO濃度為4.70±0.70μM。表明燒傷后創(chuàng)面組織中NO濃度較正常組織中NO濃度高出約15倍。
　　3、深二度燒傷創(chuàng)面組織中iNOS的表達:燒傷患者正常

4、組織及淺二度組織經石蠟包埋、切片后行免疫熒光組織化學發(fā)現，正常組織中iNOS表達不明顯，而創(chuàng)面組織中在表皮的基底層及真皮組織中iNOS明顯，其中表皮基底層iNOS的表達與表皮干細胞表面標志物角質蛋白CK19存在共定位。表明，燒傷后表皮干細胞中高表達iNOS。
　　4、深二度燒傷創(chuàng)面組織及正常組織中iNOS蛋白的表達:燒傷患者正常組織及淺二度組織經組織蛋白性蛋白印跡檢測發(fā)現，創(chuàng)面組織中NO濃度較正常組織中NO濃度高出14.8倍，表明

5、燒傷后表皮組織高表達iNOS。
　　二、原代人表皮干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定:主要是進行表皮干細胞的分離培養(yǎng)及細胞免疫化學、克隆實驗和流式等鑒定手段，我們發(fā)現:Ⅳ型膠原10min快速黏附法可以快捷、方便的實現表皮干細胞分離富集，能較好的維持表皮干細胞的干性。
　　三、NO對表皮干細胞遷移的影響及機制研究:
　?。ㄒ唬㎞O對培養(yǎng)表皮干細胞遷移的影響:我們首先進行了NO供體SNAP不同作用時間產生NO濃度和SNAP對表皮干細

6、胞的毒性檢測;通過劃痕實驗和活性工作站完成NO對表皮干細胞遷移和運動速度的檢測，以及通過細胞骨架實驗和pull down技術檢測NO促進表皮干細胞遷移可能的物質基礎。
　?。ǘ㎞O對培養(yǎng)表皮干細胞遷移的機制研究:cGMP-PKG是NO最重要的下游信號轉導途徑，為此我們通過細胞劃痕實驗、細胞運動速度實驗、細胞骨架實驗、Pull-down實驗，分別分組給予cGMP抑制劑ODQ、PKG抑制劑Rp-8pcpt-cGMPs、Rho A抑制

7、劑Rhosin、Cdc42抑制劑ZCL278、Rac1抑制劑Z62954982及SNAP處理，此外還采用Rho A、Rac1、Cdc42的特異性小干擾RNA驗證“NO通過cGMP-PKG調節(jié)活化Rho GTPase，進而影響細胞骨架蛋白F-actin的聚合，最終促進ESCs遷移”的假說。
　　1、劃痕實驗檢測cGMP\PKG\Rho GTPase信號通路在NO促進ESCs遷移中的作用，結果表明，SNAP對ESCs細胞的遷移作用可被

8、cGMP、PKG、RhoA、Rac1抑制劑阻斷，其中Rho A抑制劑的抑制作用最顯著，而Cdc42抑制劑的阻斷作用不明顯。
　　2、活細胞工作站實驗檢測cGMP\PKG\Rho GTPase信號通路在NO促進ESCs運動速度的作用，結果表明:NO供體SNAP促進ESCs細胞的運動，其作用可被cGMP、PKG、RhoA、Rac1抑制劑阻斷，其中Rho A抑制劑的抑制作用顯著，而Cdc42抑制劑阻斷SNAP對ESCs運動速度的影響弱。

9、
　　3、激光共聚焦檢測cGMP\PKG\Rho GTPase信號通路在NO對ESCs細胞骨架蛋白F-actin聚合中的作用:我們采用imageJ分析了皮層肌動蛋白(cortical actin)和絲狀偽足(filopodia)觀察細胞骨架蛋白F-actin的聚合情況。
　　4、Pull-down技術檢測cGMP\PKG在NO活化Rho GTPase中的作用:采用Pull-down技術檢測NO供體SNAP處理表皮干細胞24小

10、時對RhoA，Cdc42和Rac1的活化。結果發(fā)現，對RhoA活化作用以對照組設為1，SNAP組為4.46±0.14; ODQ+ SNAP組為0.89±0.11;Rp-8pcpt-cGMPs+SNAP組為1.52±0.12;對Rac1活化作用SNAP組為2.08±0.08，ODQ+SNAP組為0.72±0.12，Rp-8pcpt-cGMPs+SNAP組為1.22±0.17;對Cdc42活化作用SNAP組為1.16±0.24，ODQ+SN

11、AP組為1.21±0.13;Rp-8pcpt-cGMPs+SNAP組為0.89±0.13。表明NO通過cGMP、PKG調節(jié)Rho A，Rac1的活化作用。
　　5、Pull-down技術檢測不同時間SNAP對活化RhoA的作用:采用Pull down技術檢測SNAP在處理后6、12、18、24小時對RhoA，Cdc42和Rac1的活化作用。表明在給予SNAP處理后ESCs中活化的Rho GTPase持續(xù)高表達。
　　6、si

12、RNA轉染體外培養(yǎng)人表皮干細胞及siRNA干擾效率檢測:50 nM的siRNA采用脂質體2000轉染表皮干細胞，以與Rho GTPase無同源性的葡萄糖氧化酶GLO的siRNA作為陰性對照，為避免脫靶效應每一個mRNA均采用兩個不同的siRNA。采用WB檢測siRNA的干擾效率均大于75％。
　　同時我們采用RhoA、Rac1和Cdc42的特異性siRNA干擾實驗進一步驗證了NO通過Rho GTPase的RhoA和Rac1在NO促

13、進表皮干細胞遷移中的作用。
　　7、siRNA干擾后檢測Rho GTPase在NO促進ESCs遷移中的作用:采用RhoGTPase的特異性siRNA干擾目的基因的表達后進行劃痕實驗，表明，NO通過Rho GTPase的Rho A和Rac1影響表皮干細胞的遷移作用。
　　8、siRNA干擾后檢測Rho GTPase在NO促進ESCs運動中的作用:采用RhoGTPase的特異性siRNA干擾目的基因的表達后進行活性工作檢測細胞的

14、運動速度實驗，表明RhoA siRNA、Rac1 siRNA可阻斷NO對ESC運動速度的促進作用。
　　9、siRNA干擾后檢測Rho GTPase在NO促進骨架蛋白F-actin聚合中的作用:采用Rho GTPase的特異性siRNA干擾目的基因的表達后給予NO供體SNAP處理24小時。通過imageJ分析了皮層肌動蛋白(cortical actin)和絲狀偽足(filopodia)的表達觀察細胞骨架蛋白F-actin的聚合與重

15、排作用。研究表明，Rho GTPase的Rho A、Rac1的mRNA干擾小RNA可阻斷SNAP對ESCs的F-actin的聚合作用。
　　四、NO對皮膚創(chuàng)面愈合及在體表皮干細胞遷移的影響:為進一步探討NO在創(chuàng)面愈合、上皮化以及進一步驗證NO對ESC的在體遷移情況，我們在BrdU在體標記表皮干細胞基礎上采用全層皮膚缺損模型研究NO在創(chuàng)面愈合、上皮化以及對ESC遷移。應用BrdU在體標記表皮干細胞后孔器器打孔，傷口大小為直徑4.5m

16、m，分組分別給予腹腔注射生理鹽水組，甘氨酸(Gly)，一氧化氮合成底物(L-精氨酸)及一氧化氮合酶抑制劑(L-NMMA)。分別于傷后0、1、3、5、7、9天觀察創(chuàng)面愈合情況，于第9天取材做HE染色觀察創(chuàng)面上皮化情況，于第12天觀察ESC遷移情況。
　　總結:
　　1、燒傷后表皮干細胞可能通過高表達iNOS，而促進燒傷創(chuàng)面NO的大量產生;
　　2、Ⅳ型膠原快速黏附結合K-SFM角質細胞專用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)是一種簡單、快捷

17、、有效分離、純化人表皮干細胞的方法;
　　3、NO供體SNAP對體外培養(yǎng)人表皮干細胞的最佳作用濃度為100μM。
　　4、NO通過cGMP/PKG調節(jié)Rho GTPase的Rho A和Rac1的活化影響細胞骨架蛋白F-actin的聚合，進而促使表皮干細胞遷移，最終促進創(chuàng)面愈合。
　　5、在體實驗中，NO可能通過促進表皮干細胞遷移，而促進創(chuàng)面再上皮化，最終促進皮膚創(chuàng)面愈合。
　　綜上所述，燒傷后創(chuàng)面表皮干細胞可能通