微泡聯(lián)合超聲上調SDF-1-CXCR4促MSCs歸巢修復缺血心肌的實驗研究.pdf

1、研究目的:
　　1.探討UTMD調節(jié)SDF-1/CXCR4軸促靜脈移植MSCs遷移歸巢的作用及可能分子機制，為超聲聯(lián)合微泡作用下移植MSCs有效歸巢缺血心肌提供理論依據(jù);
　　2.探討診斷超聲聯(lián)合攜SDF-1微泡促靜脈移植的MSCs歸巢缺血心肌，改善大鼠心肌梗死后心功能的可行性和有效性，并初步探討其機制。
　　研究方法:
　　1.人骨髓源性與大鼠骨髓源性間充質干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及標記
　　分別通過密度

2、梯度離心法和全骨髓貼壁培養(yǎng)法對成人骨髓源性間充質干細胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)和大鼠BMSCs進行分離、純化及培養(yǎng)，前者用于體外機制研究，后者用于動物體內的細胞移植。檢測細胞周期、細胞生長曲線、超微結構。流式細胞儀檢測細胞表面標記分子，成脂及成骨誘導分化對細胞進行鑒定。為在動物體內示蹤外源性MSCs，用攜帶增強型GFP的慢病毒轉染大鼠MSCs，轉染48h后觀察M

3、SCs的綠色熒光表達及細胞毒性反應。
　　2.大鼠急性心肌梗死模型的建立與評價
　　采用結扎冠狀動脈左前降支的方法建立大鼠心肌梗死模型。模型評價方法:HE染色、Masson染色以及超聲心動圖檢測左室收縮功能。
　　3.UTMD上調SDF-1/CXCR4表達促心肌梗死后MSCs遷移歸巢的機制研究
　　(1)體外輻照參數(shù)篩選:按照均勻實驗設計，考察影響超聲輻照效果的三個主要參數(shù):超聲輻照時間、輻照強度和微泡濃度。通過

4、對SDF-1分泌量和人MSCs細胞存活率的檢測，優(yōu)選最佳的體外輻照參數(shù)配比。
　　(2)體外部分機制研究:本部分實驗全部使用成人MSCs。為充分驗證研究假設，制備兩種條件培養(yǎng)液用于體外模擬正常或缺氧的心肌環(huán)境:①正常氧含量或低氧含量環(huán)境下人心肌細胞和人心肌微血管內皮細胞共培養(yǎng)的上清液;②正?；騇I大鼠心肌組織提取液(myocardial tissue extracts，MTE)。據(jù)此把體外機制實驗分為“上清液部分”和“MTE部分”

5、。運用優(yōu)化的超聲輻照參數(shù)，考察UTMD對不同條件培養(yǎng)液中MSCs的影響?？疾熘笜税?CCK-8法檢測MSCs的存活率，ELISA法檢測SDF-1、黏附分子VCAM-1和ICAM-1的表達量，流式細胞儀檢測MSCs膜CXCR4表達，Western blot法檢測MSCs胞內CXCR4蛋白表達，熒光實時定量PCR法檢測MSCs的CXCR4基因表達水平，Transwell遷移實驗評估MSCs的體外遷移能力。
　　(3)體內部分機制研究

6、:本部分實驗使用大鼠MSCs。GFP標記的MSCs移植MI大鼠48h后，觀察外源性MSCs在靜脈移植MSCs組和超聲聯(lián)合微泡+MSCs組缺血心肌區(qū)的熒光分布，并計數(shù)陽性細胞用于統(tǒng)計學比較;未進行GFP標記的MSCs移植MI大鼠7d后，免疫組化法和Western blot法檢測各組（對照組、靜脈移植MSCs組、超聲+微泡組以及超聲+微泡+MSCs組）心肌缺血區(qū)SDF-1和CXCR4的表達。
　　4.超聲聯(lián)合攜SDF-1微泡促MSCs

7、靶向歸巢并改善大鼠心肌梗死后心功能的研究
　　(1)攜SDF-1微泡的制備及檢測:在本科室普通脂質微泡制備方法的基礎上，用共價結合法制備攜SDF-1的微泡，光鏡觀察其形態(tài)、分布，顆粒計數(shù)儀檢測其粒徑、濃度，流式細胞儀檢測SDF-1攜帶率、ELISA法檢測SDF-1攜載量和包封率。
　　(2) UTMD對缺氧預處理MSCs的影響:本部分實驗使用成人MSCs，考察微泡聯(lián)合超聲對缺氧預處理MSCs的影響。將MSCs置于低氧環(huán)境(1

8、％O2，94％ N2，5％ CO2)中暴露24h進行缺氧預處理。超聲輻照后用CCK-8法檢測細胞存活率、流式細胞儀檢測膜CXCR4表達、Transwell遷移實驗評估其體外遷移能力。
　　(3)動物實驗:本部分實驗全部使用缺氧預處理的大鼠MSCs用于移植治療。GFP標記的MSCs移植48h后，觀察外源性MSCs在靜脈移植MSCs組、MSCs+UM組（普通微泡）以及MSC+UMSDF-1組（攜SDF-1微泡）缺血心肌區(qū)的熒光分布;未

9、進行GFP標記的MSCs移植28d后，免疫組化法檢測各組（對照組、靜脈移植MSCs組、MSC+UM組以及MSC+UMSDF-1組）心肌缺血區(qū)肝細胞生長因子(HGF)的表達，Western blot法檢測SDF-1和血管內皮細胞生長因子(VEGF)的表達水平，HE染色法檢測心肌缺血區(qū)血管密度(capillary density，CD)，M型超聲評價左室收縮功能。
　　研究結論:
　　1.成功實現(xiàn)成人MSCs和大鼠MSCs的分離

10、、純化、培養(yǎng)及鑒定。按照MOI=10可成功轉染攜帶增強型GFP的慢病毒到大鼠MSCs，轉染效率高且傳代后熒光表達穩(wěn)定，可標記MSCs用于體內示蹤。
　　2.使用優(yōu)選出的體外超聲輻照參數(shù)(頻率=1MHz，T=30s，Q=0.6W/cm2，MB=106/mL)，微泡聯(lián)合超聲作用于人MSCs，可在較高細胞存活率的前提下，促進SDF-1及黏附分子VCAM-1和ICAM-1的分泌。還可上調MSCs膜CXCR4的表達，這可能得益于超聲“聲孔效

11、應”和超聲輻照后MSCs胞內CXCR4儲備的增加。
　　3.采用缺氧條件下心肌細胞和心肌血管內皮細胞上清液與心肌梗死組織提取液兩種條件培養(yǎng)液與MSCs進行共培養(yǎng)，均證實UTMD是通過上調SDF-1/CXCR4表達促MSCs歸巢遷移這一分子機制。
　　4.診斷超聲聯(lián)合微泡作用于MI模型大鼠，可促進經靜脈移植的MSCs向缺血心肌歸巢，并提高缺血心肌區(qū)SDF-1、CXCR4的表達。其中，SDF-1的高表達可能是微泡介導的超聲生物學

12、效應作用于靶區(qū)和UTMD上調MSCs旁分泌共同作用的結果。
　　5.靶區(qū)SDF-1表達量的增加，與外源性MSCs在超聲作用下膜CXCR4的表達上調，可能是UTMD上調SDF-1/CXCR4表達從而促進MSCs遷移歸巢的兩個相互作用的關鍵分子靶點。
　　6.采用共價連接法可成功制備粒徑小，濃度高，分布均勻，連接穩(wěn)定，有較高攜載量和包封率的攜SDF-1微泡。
　　7.缺氧預處理可使MSCs膜CXCR4表達上調，微泡聯(lián)合超聲

13、作用可進一步促進其功能性表達，均有利于MSCs的遷移、歸巢。
　　8.攜SDF-1微泡在超聲作用下靶向釋放形成的SDF-1局部高濃度，和缺氧預處理及超聲輻照引起的MSCs膜CXCR4表達上調，二者相互作用，共同促進外源性MSCs遷移歸巢到缺血心肌。
　　9.經靜脈移植MSCs在攜SDF-1微泡聯(lián)合超聲作用下，歸巢的MSCs數(shù)量進一步增加，并通過超聲空化效應和歸巢MSCs的旁分泌效應提高心肌缺血區(qū)VEGF和HGF的表達，促進血