CXCR-4基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合VCAM-1抗體包被促M(fèi)SCs歸巢及其對(duì)實(shí)驗(yàn)性IBD小鼠腸黏膜修復(fù)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:炎癥性腸?。↖BD）是一類腸道非特異性炎癥疾病，主要包括未定型結(jié)腸炎(Indeterminate Colitis)、漬瘍性結(jié)腸炎(UC)及克羅恩病(CD)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是發(fā)生于骨髓中一種非造血類的干細(xì)胞，具有容易獲取及無倫理學(xué)障礙、再生與多向分化潛能、低免疫原性及免疫調(diào)節(jié)等眾多優(yōu)點(diǎn)，且具有促進(jìn)IBD損傷腸黏膜愈合并矯正黏膜免疫功能異常的作用，因而成為干細(xì)胞治療IBD的首選細(xì)胞。前期的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈移植的BMS

2、Cs遷移并定植于病變腸道的數(shù)量有限，限制了其治療作用的發(fā)揮。由于干細(xì)胞的歸巢行為涉及多種趨化因子及其受體，黏附分子對(duì)等的參與。研究表明趨化因子CXC亞組受體-4/基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(CXCR4/SDF-1)與血管細(xì)胞粘附分子-1/人遲現(xiàn)抗原-4(VCAM-1/VLA-4)分子對(duì)在促干細(xì)胞歸巢中發(fā)揮著十分重要的作用。故利用CXCR-4基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合VCAM-1抗體包被BMSCs，能夠使其在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)治療的靶向性和高效性。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

3、:通過構(gòu)建CXCR-4基因修飾BMSCs、VCAM-1抗體包被BMSCs及CXCR-4基因修飾聯(lián)合VCAM-1抗體包被BMSCs，來提高BMSCs在移植治療實(shí)驗(yàn)性IBD小鼠模型中的局部定植率及療效，并探討其促進(jìn)腸黏膜愈合的機(jī)制，為臨床上采取何種靶向方式治療IBD提供理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:
　　1、探討B(tài)MSCs移植治療實(shí)驗(yàn)性IBD小鼠促損傷腸黏膜修復(fù)的免疫機(jī)制。
　　2、構(gòu)建并鑒定BMSCs、CXCR-4、VCAM

4、-1靶向性及雙重靶向性BMSCs及評(píng)估其體外遷移率。
　　3、觀察CXCR-4及VCAM-1能否促靶向性BMSCs向IBD小鼠損傷腸黏膜定向遷移并加快腸黏膜愈合。
　　4、探討靶向性BMSCs通過何種機(jī)制在腸道局部大量定植并發(fā)揮修復(fù)作用。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1、利用前期研究留取的實(shí)驗(yàn)性IBD小鼠及經(jīng)BMSCs治療后的血清標(biāo)本，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Th1相關(guān)細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α，Th2相關(guān)細(xì)胞

5、因子IL-4、IL-10及Th17相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-17的水平。
　　2、利用前期研究留取的實(shí)驗(yàn)性IBD小鼠及經(jīng)BMSCs治療后的腸道組織標(biāo)本，采用Real time PCR及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)Th1/Th2/Th17相關(guān)細(xì)胞因子的水平。
　　3、采用Real time PCR及Western Blot技術(shù)檢測(cè)腸道組織內(nèi)Th1的主要調(diào)控因子T-bet、Th2的主要調(diào)控因子GATA-3、Th17的主要調(diào)控因子ROR-γ

6、t及Treg相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β及主要調(diào)控因子Foxp3、Smad2的RNA及蛋白的表達(dá)情況。
　　4、采用骨片法從雄性BALB/C小鼠（2-3周齡）的骨片中分離并體外培養(yǎng)BMSCs（標(biāo)記為MSC組）;將攜帶CXCR-4的慢病毒轉(zhuǎn)柒入BMSCs構(gòu)建成CXCR4-BMSCs（C-MSC組）;利用抗體包被技術(shù)將兔抗小鼠VCAM-1抗體包被于BMSCs表面構(gòu)建成VCAM1-BMSCs(V-MSC組);采用基因轉(zhuǎn)染聯(lián)合抗體包被技術(shù)構(gòu)建C

7、XCR4-VCAM1-BMSCs(C-V-MSC組);采用Real time-PCR檢測(cè)并比較CXCR-4的表達(dá)量;采用Real time-PCR及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)并比較VCAM-1的表達(dá)量。
　　5、通過四組BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察、計(jì)數(shù)法測(cè)定生長(zhǎng)曲線、成骨成脂誘導(dǎo)分化鑒定、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)BMSCs表面標(biāo)志物、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定活細(xì)胞率，來比較四組BMSCs生物學(xué)特性的變化。
　　6、通過Transwel

8、l體外向SDF-1及含20％血清培養(yǎng)基遷移的實(shí)驗(yàn)，比較四組BMSCs的遷移率。
　　7、選擇雌性BALB/C小鼠（6-8周齡），分別隨機(jī)分為6組;并將構(gòu)建好的四組BMSCs標(biāo)記CM-Dil示蹤:(1)對(duì)照組（標(biāo)記為Control, Ctr組）:生理鹽水灌腸（100μl/只），灌腸后第2天，給予尾靜脈注射不合BMSCs的PBS0.1ml，n=21;(2) TNBS組（T組）:2.0mgTNBS/50％乙醇灌腸劑（100μl/只），并

9、于造模后第2天，給予尾靜脈注射不含BMSCs的PBS0.1ml，n=21;(3) TNBS-MSC移植組（MT組）:2.0mgTNBS/50％乙醇灌腸劑（100μl/只），并于造模后第2天，尾靜脈注射含BMSCs（1×106/只）的PBS0.1ml，n=21;(4) TNBS-C-MSC移植組（CMT組）:2.0mgTNBS/50％乙醇灌腸劑（100μl/只），并于造模后第2天，給予尾靜脈注射含CXCR4-BMSCs（1×106/只）的

10、PBS0.1ml，n=21;(5)TNBS-V-MSC移植組（VMT組）:2.0mgTNBS/50％乙醇灌腸劑（100μl/只），并于造模后第2天，給予尾靜脈注射含VCAM1-BMSCs（1×106/只）的PBS0.1ml，n=21;(6) TNBS-C-V-MSC移植組（CVMT組）:2.0mgTNBS/50％乙醇灌腸劑（100μl/只），并于造模后第2天，給予尾靜脈注射含CXCR4-VCAM1-BMSCs（1×106/只）的PBS0

11、.1ml，n=21。移植當(dāng)天標(biāo)記為D0，移植后第1-13天，分別記為D1-13。
　　8、觀察各組小鼠一般情況、體重變化及存活率、進(jìn)行疾病活動(dòng)度指數(shù)(TheDisease Activity Index，DAI)評(píng)分、放大鏡下管觀察結(jié)腸大體形態(tài)、測(cè)量結(jié)直腸長(zhǎng)度及進(jìn)行組織病理學(xué)。
　　9、分別于D0、D1、D3、D5、D7、D9、D11、D13天，脫頸處死小鼠3只/組，并取材血液、腸道組織、腸系膜淋巴結(jié)及脾臟，一部分進(jìn)行石蠟包埋

12、，一部分經(jīng)液氮速凍后，-80℃冰箱保存。
　　10、熒光顯微鏡下觀察BMSCs在腸道內(nèi)的定植情況，及Real time PCR檢測(cè)并比較Y染色體的性別決定區(qū)段(SRY)基因的腸道局部的相對(duì)量。
　　11、采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞增殖核抗原Ki67、血管生成指標(biāo)eNOS、腸道上皮間的緊密連接蛋白Claudin-1及JAM-1的表達(dá)情況。
　　12、采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)溶菌酶(Lysozyme)、TLR-4

13、、MyD88、TRAF-6、ERK1/2、JNK1/2、MAPK及NF-κB的表達(dá)情況。
　　13、采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)腸道組織VCAM-1(CD106)的表達(dá)情況。
　　14、采用Elisa技術(shù)檢測(cè)腸道組織VLA-4的表達(dá)情況。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、血清中Th1相關(guān)促炎性細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ及TNF-α)和Th17相關(guān)促炎性細(xì)胞因子（IL-6及IL-17）的水平在造模組中明顯升高;在BMSCs移植

14、組中明顯降低。Th2相關(guān)抑炎性細(xì)胞因子(IL-4及IL-10)的水平在造模組中無明顯變化，在BMSCs移植組中明顯升高。
　　2、局部腸道組織中Th1、Th17相關(guān)促炎性細(xì)胞因子的水平在造模組中明顯升高;在BMSCs移植組中明顯降低。Th2相關(guān)抑炎性細(xì)胞因子及Treg相關(guān)抑炎性細(xì)胞因子(TGF-β)的水平在造模組中無明顯變化，在BMSCs移植組中明顯升高。
　　3、局部腸道組織中調(diào)控因子T-bet(Th1)及ROR-γt(T

15、h17)的表達(dá)在造模組中明顯升高;在BMSCs移植組中明顯降低。GATA-3(Th2)和Foxp3(Treg)的表達(dá)在造模組中無明顯變化，Smad2(Treg)的表達(dá)在造模組中降低;在BMSCs移植組中明顯升高。
　　4、將CXCR-4基因孚入BMSCs后，可檢測(cè)到C-MSC組高表達(dá)CXCR-4;將VCAM-1抗體包被于BMSCs后，可檢測(cè)到V-MSC組高表達(dá)VCAM-1;將VCAM-1包被于CXCR-4轉(zhuǎn)染的BMSCs后，可檢測(cè)

16、到C-V-MSC組同時(shí)高表達(dá)CXCR-4及VCAM-1，且CXCR-4的表達(dá)量高于C-MSC組，VCAM-1的表達(dá)量高于V-MSC組。
　　5、觀察四組BMSCs均呈長(zhǎng)梭形并束狀排列;生長(zhǎng)曲線均為S形;成脂肪轉(zhuǎn)化率均在60％左右;骨結(jié)節(jié)的個(gè)數(shù)在20個(gè)左右/視野;細(xì)胞表型鑒定未發(fā)生改變(CD105+，CD90+，CD11b-，CD45-);活細(xì)胞比率均在90％以上;以上結(jié)果無明顯的差異;在細(xì)胞周期檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CXCR-4的BMS

17、Cs復(fù)制期增多;在細(xì)胞凋亡檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)V-MSC組及C-V-MSC組細(xì)胞凋亡率增加。
　　6、體外遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí):在SDF-1的誘導(dǎo)下，C-MSC組的遷移率＞C-V-MSC組＞V-MSC組＞MSC組;在20％FBS誘導(dǎo)下，C-V-MSC組的遷移率＞C-MSC組＞V-MSC組＞MSC組。
　　7、TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性IBD模型，小鼠精神狀態(tài)差、體重減輕及存活率明顯下降，DAI及組織病理學(xué)評(píng)分明顯上升，肉眼觀察見結(jié)直腸明顯縮短、縮窄

18、，伴有充血、出血，病理見糜爛、潰瘍形成、大量中性粒細(xì)胞浸潤于黏膜及黏膜下層，與正常組比較均有明顯差異;MT組、CMT組、VMT組及CVMT組移植后第2天，與T組相比，臨床癥狀好轉(zhuǎn)、體重及存活率開始上升，DAI及組織病理學(xué)評(píng)分下降，肉眼觀察結(jié)直腸充血、出血及縮窄情況減輕;CVMT組癥狀緩解、體重恢復(fù)及組織病理學(xué)改變較其他治療組快。
　　8、熒光顯微鏡下可見MT組、CMT組、VMT組及CVMT組的結(jié)腸組織均存在紅色熒光;四組BMSCs

19、移植組及雄性組的腸道黏膜組織中均能檢測(cè)到SRY基因;體內(nèi)定植率C-V-MSC組＞C-MSC組＞V-MSC組＞MSC組。
　　9、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:IBD模型小鼠接受BMSCs移植后，腸黏膜內(nèi)Ki67、eNOS、Claudin-1及JAM-1的表達(dá)量較未接受BMSCs移植組有所升高。
　　10、Western Blot的結(jié)果顯示:TLR-4、MyD88、TRAF-6及NF-κ3在T組(D0)中表達(dá)量增加，MT、CMT、

20、VMT及CVMT組D3天腸道組織內(nèi)TLR-4、MyD88、TRAF-6及NF-κB的表達(dá)量較T組均下降，尤其以CVMT組下降最明顯。Lysozyme在T組中表達(dá)量下降，治療組均升高，以CMT組及VMT組升高明顯。ERK1/2及JNK1/2在T組中相對(duì)表達(dá)量下降，MAPK的表達(dá)量升高;與T組相比，MT組、CMT組、VMT組及CVMT組，ERK1/2及JNK1/2的蛋白表達(dá)量均升高，MAPK蛋白的表達(dá)量降低，以CVMT組降低最為明顯。

21、>　　11、檢測(cè)腸道內(nèi)VCAM-1/VLA-4的含量結(jié)果顯示:Control組為41.75％;T組下降為18.73％; BMSCs移植組不同程度地升高，CVMT組(73.51％)＞VMT組(67.10％)＞CMT組(66.55％)＞MT組(51.42％)。Control組中含有一定量的VLA-4，D3天時(shí)，T組升高;MT、CMT、VMT及CVMT組較T組的含量減少，減少程度為CVMT組＞VMT組＞CMT組＞MT組;D7天時(shí)含量基本恢復(fù)正

22、常，無差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　1、BMSCs能夠通過抑制促炎性細(xì)胞因子、促進(jìn)抑炎性細(xì)胞因子的分泌及恢復(fù)Th1/Th2及Th17/Treg細(xì)胞的平衡，來調(diào)控實(shí)驗(yàn)性IBD小鼠的全身及局部免疫狀態(tài)。
　　2、利用CXCR-4基因轉(zhuǎn)柒及VCAM-1抗體包被BMSCs，幾乎不會(huì)改變BMSCs的生物學(xué)活性，且二者在BMSCs表面可協(xié)同表達(dá)。
　　3、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了靶向組BMSCs的遷移率增加，且CXCR-4及VCAM