白術(shù)多糖對大腸桿菌腹瀉模型小鼠腸道黏膜修復(fù)機(jī)理研究.pdf

1、大腸桿菌腹瀉是獸醫(yī)臨床常見的致死率較高病癥之一。為了科學(xué)研究不同藥物對于大腸桿菌腹瀉的防治機(jī)制，許多研究者通過建立試驗(yàn)動(dòng)物大腸桿菌腹瀉模型，如大鼠、小鼠、兔和豚鼠等，觀察檢測模型動(dòng)物的腹瀉情況，臨床癥狀，組織器官病理變化和腸道黏膜修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞因子（如EGF、TGF-β、TGF-α等），并且腸道黏膜修復(fù)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平可評估藥物對于受損腸道的作用。
　　本研究以白術(shù)多糖能緩解大腸桿菌腹瀉癥狀為目標(biāo)，在建立小鼠大腸桿菌腹瀉模型

2、的基礎(chǔ)上，以白術(shù)健脾益氣，能醫(yī)泄利，保護(hù)腸道等功能為切入點(diǎn)，通過統(tǒng)計(jì)大腸桿菌腹瀉小鼠腹瀉率，腹瀉指數(shù)，觀察小鼠臨床癥狀，剖檢癥狀，組織學(xué)形態(tài)變化，超微結(jié)構(gòu)變化，并利用免疫組化和實(shí)時(shí)熒光相對定量法檢測腸道黏膜修復(fù)細(xì)胞因子和基因的表達(dá)情況，來探索評價(jià)白術(shù)多糖對于大腸桿菌腹瀉的作用，并初步探討其防治腹瀉的機(jī)制。
　　試驗(yàn)一小鼠大腸桿菌腹瀉模型的建立
　　本試驗(yàn)通過構(gòu)建小鼠大腸桿菌感染模型，觀察小鼠腹瀉情況、臨床癥狀與剖檢癥狀，應(yīng)用

3、切片技術(shù)、電鏡技術(shù)對小鼠的組織學(xué)變化和超微結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行觀察。方法:將20只ICR小鼠隨機(jī)。分成兩組，模型組與空白組。模型組腹腔注射大腸桿菌O1115.4×107cfu/ml，空白組注射等體積生理鹽水，統(tǒng)計(jì)小鼠的稀便級，計(jì)算稀便率，剖檢小鼠，制作H.E切片、透射電鏡切片、掃面電鏡樣品。結(jié)果:24h時(shí)，模型組小鼠腹瀉率為100％，腹瀉指數(shù)為0.34，與空白組差異顯著，腹瀉模型成功造模成功;攻菌后24h后，模型組小鼠各段腸道均有損傷;十二指腸

4、的損傷較為嚴(yán)重，腸絨毛變短，絨毛結(jié)構(gòu)被破壞，腸壁破損;透射電鏡下可觀察到模型組線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。
　　試驗(yàn)二白術(shù)多糖對小鼠大腸桿菌腹瀉防治效果的影響
　　本試驗(yàn)通過研究白術(shù)多糖對腹瀉小鼠的臨床癥狀、剖檢變化的影響，探討白術(shù)多糖對大腸桿菌造成小鼠腹瀉的防治效果，為揭示白術(shù)多糖對小鼠腹瀉的防治機(jī)制提供前提。方法:購買白術(shù)粉末用醇沉法制白術(shù)多糖，制得粗多糖后用苯酚-硫酸法測定多糖含量，結(jié)果:白術(shù)含多糖38.76％。隨機(jī)選

5、取ICR小鼠100只隨機(jī)分為4組，即空白組，治療組，預(yù)防組，陽性組，每組25只。預(yù)防組提前3d灌胃白術(shù)多糖0.04mg/ml，0.2ml/只（多糖:0.0059mg/只）。治療組，預(yù)防組，陽性組腹腔注射大腸桿菌5.4×107cfu/ml（0.1 ml/只），空白對照組注射等體積生理鹽水。觀察小鼠的腹瀉情況。分別于1h，8h，24h，48h，72h，96h，120h每組撲殺剖檢3只小鼠。記錄小鼠剖檢情況。結(jié)果:陽性組6h開始出現(xiàn)腹瀉癥狀，

6、預(yù)防組與治療組8h開始出現(xiàn)腹瀉癥狀，剖檢發(fā)現(xiàn)預(yù)防組小鼠小腸有輕微出血癥狀，治療組小鼠十二指腸暗紅充血，腸壁變薄，陽性組小鼠腸道充血出血，十二指腸段充血較嚴(yán)重;24h時(shí)陽性組的腹瀉率為82.6％，與預(yù)防組43.48％和治療組34.8％差異顯著(P＜0.05)，陽性組的腹瀉指數(shù)也顯著高于預(yù)防組與治療組（P＜0.05）;96h后，預(yù)防組與治療組開始好轉(zhuǎn)，陽性組小鼠剖檢發(fā)現(xiàn)癥狀較嚴(yán)重，用藥組小鼠恢復(fù)時(shí)間較短，腸道恢復(fù)情況較好。結(jié)果表明白術(shù)多糖對

7、大腸桿菌所導(dǎo)致的小鼠腹瀉有一定的防治效果，主要體現(xiàn)在腹瀉初期白術(shù)多糖減緩腹瀉癥狀，保護(hù)腸道粘膜，對于大腸桿菌所致腹瀉的后續(xù)治療有一定效果。
　　試驗(yàn)三白術(shù)多糖對大腸桿菌腹瀉小鼠腸道組織形態(tài)學(xué)的影響
　　為進(jìn)一步探究白術(shù)多糖對受損腸道黏膜的影響，本試驗(yàn)使用白術(shù)多糖作用于大腸桿菌腹瀉模型的小鼠，觀察小鼠組織形態(tài)和超微組織形態(tài)變化，進(jìn)一步探索白術(shù)多糖對小鼠腹瀉的防治機(jī)制。方法:多糖制備和小鼠分組處理方法同試驗(yàn)二，小鼠分別于1h，8

8、h，24h，48h，72h，96h，120h時(shí)每組剖檢3只小鼠，取十二指腸制作H.E切片、掃描電鏡切片與透射電鏡切片，結(jié)果表明，攻菌后1h，預(yù)防組無較明顯病變;治療組腸腺出血，輕微水腫，掃描電鏡下腸絨毛較整齊;陽性組腸腺有出血，腸絨毛開始萎縮，掃描電鏡下絨毛頂端脫落損壞，部分絨毛萎縮。24h時(shí)，陽性組腸絨毛大量損壞脫落，癥狀較預(yù)防組與治療組嚴(yán)重。96h時(shí)預(yù)防組與治療組開始好轉(zhuǎn)，陽性組癥狀嚴(yán)重。透射電鏡下可觀察到，小鼠腹瀉中期時(shí)即24h之

9、后，用藥組小鼠腸上皮細(xì)胞微絨毛排列較整齊，線粒體腫脹，核變形，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張;陽性組小鼠腸上皮細(xì)胞微絨毛減少，倒伏，細(xì)胞核高度不規(guī)則，大量線粒體變性形成髓鞘樣結(jié)構(gòu)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量擴(kuò)張含有顆粒狀包涵體。結(jié)果表明白術(shù)多糖用藥組對于小腸上皮細(xì)胞微絨毛保護(hù)較好，白術(shù)多糖具有保護(hù)腸道粘膜的作用，參與細(xì)胞代謝的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器的病變程度較輕說明白術(shù)多糖可能對腸道因子有有益的調(diào)節(jié)作用。
　　試驗(yàn)四白術(shù)多糖對大腸桿菌腹瀉小鼠腸道修復(fù)機(jī)制的研究<

10、br>　　本試驗(yàn)通過免疫組化和real time PCR的方法來研究腸道損傷后，隨著時(shí)間的變化，白術(shù)多糖對腸道內(nèi)的表皮生長因子受體EGFR和TGF-β1（轉(zhuǎn)化生長因子-β1）的影響。方法:藥物制備與小鼠分組處理同試驗(yàn)二，分別于1h，8h，24h，48h，72h，96h，120h每組撲殺剖檢3只小鼠，制作免疫組化切片和用real time PCR法來檢測腸道中EGFR和TGF-β1的表達(dá)情況。結(jié)果:腹瀉初期，空白組與其余各組小鼠EGFR陽

11、性染色大部分出現(xiàn)在隱窩上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)上;TGF-β1陽性染色位于小腸淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及部分小腸上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi);此時(shí)各組EGFR和TGF-β1的表達(dá)量與空白組無顯著性差異;腹瀉中期，腸黏膜損傷最為嚴(yán)重，此時(shí)EGFR與TGF-β1出現(xiàn)大量陽性染色，此時(shí)EGFR與TGF-β1表達(dá)量分別達(dá)到峰值，各組表達(dá)量與空白組相比差異顯著(P＜0.05);腹瀉后期，預(yù)防組與治療組EGFR表達(dá)量與24h相比降低但差異不顯著，陽性組EGFR表達(dá)量大幅度

12、減少，差異極顯著（P＜0.01），說明白術(shù)多糖能影響EGFR的表達(dá)，使其維持在一個(gè)較高的表達(dá)水平中，促進(jìn)上皮細(xì)胞快速增殖;各組TGF-β1陽性表達(dá)減弱，但預(yù)防組與治療組TGF-β1表達(dá)量較高，說明白術(shù)多糖對于TGF-β1有調(diào)節(jié)作用，通過調(diào)節(jié)TGF-β1來促進(jìn)腸道黏膜修復(fù)。
　　結(jié)論:白術(shù)多糖對大腸桿菌誘導(dǎo)的小鼠腹瀉有一定防治效果，能有效減緩腹瀉癥狀，減少小鼠的腹瀉率。剖檢發(fā)現(xiàn)對腹瀉小鼠的腸道有明顯的保護(hù)作用，預(yù)防組小鼠的保護(hù)效果最