柔性金屬對大腸桿菌毒性機(jī)理的研究.pdf

1、一方面，隨著現(xiàn)代工業(yè)的不斷發(fā)展，金屬污染逐漸成為威脅地球生命安全的重要因素。另一方面，一些金屬作為抗菌器材在許多領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用，為人類生活尤其是醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)帶來極大便利。這兩者都是金屬對細(xì)胞毒性的客觀反應(yīng)。這使得金屬的細(xì)胞毒性機(jī)理日益成為國內(nèi)外研究的熱點。眾多研究將金屬的毒性歸因于氧化應(yīng)激，即通過產(chǎn)生活性氧化物質(zhì)破壞細(xì)胞的DNA、蛋白等組分而使細(xì)胞致毒。然而最新研究表明銅對大腸桿菌致毒時首先破壞細(xì)胞中心代謝通道中一類關(guān)鍵性的鐵-硫簇

2、脫水酶，且該作用源于銅的強(qiáng)親硫性。銀、汞、鎘、鋅、鉛、鎳、鈷和錳與銅類似同樣具備強(qiáng)親硫性，都屬于柔性金屬的范疇，因此推測這些金屬的毒性機(jī)理存在相似性。本研究系統(tǒng)研究了各柔性金屬對大腸桿菌的抑制作用、對細(xì)胞體外含外露[4Fe-4S]簇的延胡索酸酶A(fumA)的作用以及生長抑制臨界濃度下對細(xì)胞體內(nèi)各類酶的作用，對柔性金屬的毒性機(jī)理進(jìn)行了全面深入的分析，表明了該類酶為柔性金屬銀、汞、鎘和鋅致毒的第一靶點，確認(rèn)了金屬的“親硫性”為其致毒的關(guān)鍵

3、性因素。研究主要內(nèi)容包括：
　　 1.金屬對細(xì)胞毒性機(jī)理的探索
　　 研究已經(jīng)證明鐵使細(xì)胞致毒的原因是因為它能催化Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基(·OH)而破壞細(xì)胞。銅、三價鉻與鐵同樣具備該能力，且抗壞血酸能夠作為一種促氧化劑而促進(jìn)金屬的還原及Fenton反應(yīng)的循環(huán)發(fā)生。為了探索銅對細(xì)胞的致死率與氧化應(yīng)激的關(guān)系，且驗證銅毒性與羥基自由基導(dǎo)致的細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞的猜想，研究了Cu(Ⅱ)與抗壞血酸(L-AscA)體系對E.coli

4、的致死率，并與同能參與Fenton反應(yīng)的Fe(Ⅲ)和Cr(Ⅲ)的作用進(jìn)行了比較分析，進(jìn)而用電子自旋共振技術(shù)(ESR)分析了各體系產(chǎn)生的·OH的量與致死率的關(guān)系。結(jié)果表明：L-AscA的加入極大增強(qiáng)了Cu(Ⅱ)對E.coli的致死率，且兩者共存體系下E.coli死亡率呈Cu(Ⅱ)濃度依賴。相應(yīng)的，0.01％ L-AscA的加入加倍了0.2 mM Cu(Ⅱ)體系中的·OH濃度，與致死率分析中L-AscA的加入極大增強(qiáng)了Cu(Ⅱ)的毒性一致；

5、此外，L-AscA/Cu(Ⅱ)共存體系中，Cu(Ⅱ)濃度高于0.1 mM時，產(chǎn)生的·OH濃度與Cu(Ⅱ)濃度成正比，同樣與致死率分析中Cu(Ⅱ)濃度依賴結(jié)果相吻合。而200μM的Fe(Ⅲ)和Cr(Ⅲ)未能檢測到羥基自由基的產(chǎn)生，它們對細(xì)胞的毒性也相對弱于Cu(Ⅱ)。分析結(jié)果綜合表明在致死劑量下Cu(Ⅱ)的確能誘發(fā)·OH的產(chǎn)生，且產(chǎn)生量與銅對大腸桿菌的致死率成正相關(guān)。
　　 但有趣的是，當(dāng)Cu(Ⅱ)濃度為0.02 mM時，與0.0

6、1% L-AscA共存體系下，ESR無法檢測到·OH，然而該體系對E.coli的毒性反而大于檢測到較高·OH濃度的0.2 mM Cu(Ⅱ)單獨系統(tǒng)。這意味著，在較低Cu(Ⅱ)濃度下，存在氧化應(yīng)激之外的其它毒性機(jī)制。與此同時，最新研究表明，由于Cu(Ⅱ)尤其是Cu(Ⅰ)的強(qiáng)親硫性，在非致死劑量下便能破壞E.coli中外露的鐵-硫簇脫水酶而成為其致毒的首要原因，該研究成果確切解釋了本研究中出現(xiàn)的這一矛盾現(xiàn)象。
　　 2.柔性金屬對E

7、.coli的抑制作用分析
　　 銅為柔性金屬中的一種，為了驗證這種由于強(qiáng)親硫性而致毒的機(jī)理是否具有共通性，首先分析了銀、汞、鎘、鋅、鉛、鎳、鈷、錳在標(biāo)準(zhǔn)基本培養(yǎng)基中對E.coli的抑制作用。并以銀為代表，深入分析了其抑制作用的影響因素。
　　 結(jié)果表明，在簡單基本培養(yǎng)基中，極低濃度的Ag(Ⅰ)和Hg(Ⅱ)(0.15μM)便能抑制E.coli生長，這與這兩種金屬公認(rèn)的極強(qiáng)抗菌性相一致。較高濃度的Ni(Ⅱ)、Co(Ⅱ)(分別

8、為400μM和200μM)才開始抑制細(xì)胞的生長；其它柔性金屬未表現(xiàn)出明顯抑制作用；此外，銀對E.coli的抑制作用與好氧或厭氧狀態(tài)無關(guān)，而與培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基組分和菌液濃度高度相關(guān)，表明了其毒性與氧化應(yīng)激無關(guān)。
　　 3.柔性金屬對活體細(xì)胞外fumA的作用
　　 延胡索酸酶A(fumA)是一種典型的鐵-硫簇脫水酶，因為其鐵-硫簇外露很容易成為一些有毒物質(zhì)的攻擊對象。為了驗證柔性金屬是否能破壞[4Fe-4S]簇而使fumA

9、失活，首先在厭氧條件下提純了延胡索酸酶A，并逐一測定了上述八種柔性金屬對純化fumA活性的作用。通過底物保護(hù)，失活fumA的活性還原、ESR對失活后fumA的Fe-S簇結(jié)構(gòu)解析以及酶失活過程中同步鐵原子釋放等研究手段對柔性金屬的作用機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)分析。
　　 微摩爾濃度的Ag(Ⅰ)、Hg(Ⅱ)和相對較高濃度的Cd(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)能以極快的速度使純化fumA失去活性，使fumA失活的能力與其親硫性強(qiáng)弱相吻合，但高達(dá)毫摩爾濃度的P

10、b(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Co(Ⅱ)和Mn(Ⅱ)未對fumA活性產(chǎn)生影響。ESR和鐵離子釋放分析證實了各金屬作用于酶的活性位點[4Fe-4S]簇，而且失活后的酶能夠通過Fe-S簇重建而重新獲得活性。Ag(Ⅰ)、Hg(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)作用后fumA的[4Fe-4S]簇被完全降解，而Zn(Ⅱ)作用下失活后則部分呈[3Fe-4S]形式。
　　 4.柔性金屬對活體細(xì)胞內(nèi)各類酶的作用。
　　 一個關(guān)鍵問題是鐵-硫簇酶是否為柔性金屬Ag

11、(Ⅰ)、Hg(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)使細(xì)胞致毒過程中的首要攻擊目標(biāo)。為此必須通過細(xì)胞活體內(nèi)的研究進(jìn)行確認(rèn)。因此，首先測定了各金屬對E.coli的生長-抑制劑量；繼而在對應(yīng)邊界劑量下，分析了各金屬對細(xì)胞中含外露[4Fe-4S]簇的脫水酶活性的影響，同時研究了各金屬對Fe-S簇組裝(Isc)系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明致毒邊界劑量下的Ag(Ⅰ)、Hg(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)便能破壞外露的[4Fe-4S]簇酶fumA、異丙基蘋果酸異構(gòu)酶和

12、6-磷酸葡萄糖脫水酶，而且失活后的酶活性同樣可以被還原。而且這四種金屬不能使幾種其它類型的酶失活，這些酶包括不含F(xiàn)e-S簇的β-半乳糖苷酶、蘋果酸脫氫酶以及含有內(nèi)嵌式鐵-硫簇的NdhⅠ脫氫酶；此外四種金屬都能破壞E.coli中的鐵-硫簇組裝系統(tǒng)。結(jié)果綜合表明了活體細(xì)胞內(nèi)各金屬在開始抑制細(xì)胞生長的劑量下便能破壞這一類含外露[4Fe-4S]簇的脫水酶，且其作用具有專一性。
　　 總之，本研究結(jié)果表明了柔性金屬的毒性機(jī)理存在共通性。柔