促紅細(xì)胞生成素通過上調(diào)SDF-1促進(jìn)缺血損傷心肌的修復(fù).pdf

1、心肌梗死(myocardium infarction，MI)是引起心力衰竭的重要原因。研究者們正在尋求各種有效的方法以改善心肌梗死后的心功能狀況。越來越多的研究證實(shí)，多種干細(xì)胞能參與損傷心肌的修復(fù)并在一定種程度上改善受損后的心功能。但干細(xì)胞的活化、歸巢、存活、增殖以及分化等過程依賴一些小分子蛋白的作用，因此現(xiàn)在又提出了運(yùn)用小分子蛋白治療心肌梗死的策略。研究報(bào)道，在缺血性心肌損傷模型中，促紅紅細(xì)胞生成 (EPO)具有抗凋亡和促血管生成的效

2、應(yīng)，并能減小梗死面積，但其具體的作用機(jī)制尚不清楚。據(jù)研究報(bào)道，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 (SDF-1)能調(diào)節(jié)骨髓干細(xì)胞（BMSCs）歸巢到受損的心肌組織，通過促進(jìn)梗死周圍區(qū)域的血管生成和減少缺血性心肌細(xì)胞的凋亡而達(dá)到心肌保護(hù)作用。另有研究提示，在經(jīng)EPO處理的缺血損傷的心肌組織中SDF-1的表達(dá)明顯升高，心功能也得到明顯改善。因此，我們推測EPO可能通過上調(diào)SDF-1的表達(dá)而促進(jìn)了損傷心肌的修復(fù)。
　　 EPO在與其受體EPOR結(jié)合后可

3、以激活PI3K/Akt，ERK1/2/MAPK和JAK2/STAT3等信號通路而參與一系列生理或病理反應(yīng)。在缺血損傷的心肌中EPO通過什么信號機(jī)制來調(diào)控SDF-1表達(dá)的尚無報(bào)道，而STAT3是早已被認(rèn)可的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，能調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)?；谝陨涎芯炕A(chǔ)，我們設(shè)想：EPO對受損心功能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過激活JAK2/STAT3信號而促進(jìn)SDF-1的表達(dá)，繼而上調(diào)的SDF-1通過其促進(jìn)BMSCs的歸巢，新生血管的形成以及抑制細(xì)

4、胞凋亡等作用，最終使得心肌梗死面積減小而改善心功能。
　　 第一部分、SDF-1在EPO保護(hù)缺血損傷心肌過程中的作用
　　 目的：本研究旨在探討SDF-1在EPO保護(hù)受損心肌過程中的作用。
　　 方法：建立C57BL/6小鼠心肌梗死模型。在左前降支冠狀動脈結(jié)扎后立即給予心肌組織內(nèi)EPO（3000U/kg）或等量的生理鹽水注射；術(shù)后第1天，從尾靜脈注射SDF-1的中和抗體（25μg/只）或等量的IgG進(jìn)行干預(yù)，每隔

5、2天注射一次，共持續(xù)兩周。采用ELISA，qRT-PCR,，免疫組化及免疫熒光方法檢測心肌組織中SDF-1的表達(dá)；術(shù)后的第3天，TUNEL法檢測梗死周圍心肌組織內(nèi)的細(xì)胞凋亡情況；在第14天時(shí)，流式細(xì)胞技術(shù)檢測心肌組織中BMSCs的歸巢情況；在第4周時(shí)，通過免疫組化和免疫熒光方法檢測血管密度，并測定心肌梗死面積和心功能。
　　 結(jié)果：ELISA檢測結(jié)果顯示，在EPO處理的小鼠心肌組織內(nèi)SDF-1的表達(dá)在心梗后第1天即開始出現(xiàn)明顯上

6、調(diào)，到第4天時(shí)達(dá)到高峰，第7天出現(xiàn)下降趨勢。---，伴隨著SDF-1表達(dá)的升高，EPO處理組小鼠的心肌中凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少，同時(shí)歸巢至受損心肌的各類BMSCs以及心肌內(nèi)的血管密度均出現(xiàn)明顯增加，心功能亦得到改善。給予SDF-1中和抗體進(jìn)行干預(yù)后的小鼠與EPO組小鼠比較，其心肌組織內(nèi)的細(xì)胞凋亡率上升，心肌內(nèi)歸巢的干細(xì)胞數(shù)量和血管密度明顯減少，改善的心功能也出現(xiàn)惡化。
　　 結(jié)論：SDF-1通過介導(dǎo)EPO的促血管生成和抗凋亡作用，并

7、誘導(dǎo)BMSCs的歸巢，從而在EPO的心肌保護(hù)過程中起著重要作用。
　　 第二部分、EPO活化JAK2/STAT3信號而上調(diào)SDF-1表達(dá)
　　 目的：心臟主由心肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞和心臟內(nèi)皮細(xì)胞三種細(xì)胞組成，本部分旨在明確EPO主要對哪種類型細(xì)胞的SDF-1表達(dá)產(chǎn)生影響并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：分離培養(yǎng)成年小鼠的心肌細(xì)胞，心臟成纖維細(xì)胞和心臟內(nèi)皮細(xì)胞，并分別在低氧環(huán)境(1％ O2，5％ CO2和 94％ N2

8、)下給予 EPO(10 IU/mL)處理，采用ELISA法檢測SDF-1的表達(dá)并用TUNEL法檢測各種細(xì)胞的凋亡情況；同時(shí)分別給予1 mMwortmannin，25mM PD98059或1 μM pPYLKTK-mts分別將PI3K/Akt，ERK1/2/MAPK和 JAK2-STAT3三條信號途徑阻斷后，通過觀察SDF-1的變化情況來初步判斷促進(jìn)其表達(dá)的分子機(jī)制。
　　 結(jié)果：ELISA結(jié)果顯示，在缺氧2h后，EPO處理組的心

9、肌細(xì)胞中SDF-1表達(dá)即開始升高，8h時(shí)達(dá)到峰值，同時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡率較低氧組也明顯降低，但該效應(yīng)能被SDF-1的中和抗體所抑制。在心臟成纖維細(xì)胞中，低氧刺激也能促進(jìn)SDF-1表達(dá)上調(diào)，但對EPO無明顯反應(yīng)。而低氧和EPO處理時(shí)對內(nèi)皮細(xì)胞中SDF-1的表達(dá)均無明顯影響，但當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基中加入重組SDF-1蛋白后，可以檢測到VEGF的表達(dá)升高。在EPO處理的心肌細(xì)胞中分別加入wortmannin，PD98059，pPYLKTK-mts后

10、，僅pPYLKTK-mts組中的SDF-1表達(dá)出現(xiàn)明顯下調(diào)，并伴隨有心肌細(xì)胞的凋亡率增加。另外western blot 結(jié)果顯示EPO組心肌細(xì)胞中p-STAT3的表達(dá)也增加。
　　 結(jié)論：EPO通過活化JAK2/STAT3信號而上調(diào)心肌細(xì)胞中SDF-1的表達(dá)，繼而發(fā)揮其對受損細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　 綜合第一及第二部分的結(jié)果，本研究證明了EPO通過激活JAK2/STAT3信號而上調(diào)SDF-1的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)BMSCs歸巢至