SDF-1-CXCR4在腎癌細(xì)胞核定位序列中的初步研究.pdf

1、本文目的： 腎癌(Renal cell carcinoma，RCC)是常見的泌尿系腫瘤之一，占成人惡性腫瘤的2-3％.近年來研究發(fā)現(xiàn)腎癌是多基因相關(guān)腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)機制尚不完全清楚.趨化因子是一類小分子量(8～14 kDa)蛋白質(zhì)，它可以同源G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，引發(fā)細(xì)胞應(yīng)答，研究發(fā)現(xiàn)趨化因子SDF-1結(jié)合其特異性受體CXCR4，不僅在宿主對病原因子的感染、組織修復(fù)和炎癥反應(yīng)，免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化中起了重要作用，而且

2、與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、趨化、遷移密切相關(guān).SDF-1/CXCR4在腎細(xì)胞癌中的相互作用尚不完全清楚，在前期進(jìn)行的實驗中，我們首次發(fā)現(xiàn)經(jīng)SDF-1處理24小時后，共聚焦顯微鏡下觀察EGFP-CXCR4重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染腎透明細(xì)胞癌A498細(xì)胞后表達(dá)產(chǎn)物由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并研究腎癌病理標(biāo)本發(fā)現(xiàn)：腎癌原發(fā)灶中CXCR4未出現(xiàn)核定位，而在腎癌轉(zhuǎn)移灶中出現(xiàn)了CXCR4的核定位，我們推測SDF-1與CXCR4結(jié)合后，CXCR4向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，并

3、直接或間接傳遞了某些信號，CXCR4在細(xì)胞核內(nèi)的信號通路可能與腎癌轉(zhuǎn)移相關(guān).本實驗擬構(gòu)建不同長度區(qū)段的CXCR4重組表達(dá)載體初步尋找CXCR4可能的核定位序列，從而為探索抑制腎癌轉(zhuǎn)移的可能靶標(biāo)奠定基礎(chǔ). 方法： 應(yīng)用核定位分析軟件結(jié)合實驗，尋找CXCR4可能的核定位序列，合成帶有HindⅢ和BglⅡ酶切位點的引物，以EGFP-CXCR4為模板，運用PCR擴增相應(yīng)的目的片段，并將目的片段連接至pMD19-T載體中，將重組T

4、載質(zhì)粒用HindⅢ和BglⅡ雙酶切，同時將pEGFP-N1用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，由于BglⅡ與BamHⅠ粘性末端相同，將酶切后目的片段與pEGFP-N1連接，獲得三個不同長度區(qū)段的CXCR4與綠色熒光蛋白pEGFP-N1重組表達(dá)載體.Fugene HD介導(dǎo)轉(zhuǎn)染腎癌A498細(xì)胞，野生型全長EGFP-CXCR4(加SDF-1及不加SDF-1)及pEGFP-N1空載體轉(zhuǎn)染24h加入SDF-1刺激因子刺激24h后共聚焦觀察，重組表達(dá)載

5、體EGFP-CXCR4(1～267bp)、EGFP-CXCR4(1～510bp)、EGFP-CXCR4(1～765bE)轉(zhuǎn)染24小時加SDF-1刺激因子24h后共聚焦觀察CXCR4不同區(qū)段重組表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)定位. 結(jié)果： 1、雙酶切和測序結(jié)果表明CXCR4不同區(qū)段重組表達(dá)載體EGFP-CXCR4(1～267bp)、EGFP-CXCR4(1～510bp)、EGFP-CXCR4(1～765bp)構(gòu)建成功，無堿基突變及讀碼框

6、架的改變。 2、生物信息學(xué)分析軟件PSORTⅡ Prediction發(fā)現(xiàn)第146至149氨基酸殘基RPRK可能是CXCR4分子的核定位序列. 3、共聚焦顯微鏡觀察CXCR4及pEGFP-N1空載體在A498細(xì)胞內(nèi)定位情況： pEGFP-N1空載體轉(zhuǎn)染A498細(xì)胞24小時后加入SDF-1(200ng/ml)刺激因子24小時其表達(dá)產(chǎn)物呈細(xì)胞均勻分布，未經(jīng)SDF-1刺激野生全長EGFP-CXCR4轉(zhuǎn)染A498細(xì)胞48

7、h后其表達(dá)產(chǎn)物主要呈細(xì)胞質(zhì)分布，野生型全長EGFP-CXCR4轉(zhuǎn)染A498細(xì)胞24小時后加入SDF-1(200ng/ml)刺激因子24小時其表達(dá)產(chǎn)物呈細(xì)胞核聚集，部分定位于細(xì)胞質(zhì)，EGFP-CXCR4在加入SDF-1出現(xiàn)核定位. 4、共聚焦顯微鏡觀察不同長度CXCR4缺失體在A498細(xì)胞內(nèi)定位情況： CXCR4不同缺失體轉(zhuǎn)染A498細(xì)胞24小時加入SDF-1(200ng/ml)刺激因子24小時后觀察，EGFP-CXCR