“心肌”微環(huán)境中Wnt11與BMP2協(xié)同作用促大鼠BM-MSCs分化為心肌樣細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：建立心肌細(xì)胞與BM-MSCs共培養(yǎng)體系，模擬“心肌”微環(huán)境的旁分泌作用，探討在此微環(huán)境中，Wnt11與BMP2協(xié)同作用對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrow-mesenchymal stem cells，BM-MSCs)分化為心肌樣細(xì)胞的影響。
　　 方法：應(yīng)用Ficoll液密度梯度離心法，分離大鼠BM-MSCs，并純化擴(kuò)增；Wnt11真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞和心肌細(xì)胞；在體外采用Transwell共培

2、養(yǎng)體系，將BM-MSCs和新生S-D大鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，模擬細(xì)胞移植后心肌微環(huán)境的旁分泌狀態(tài)，觀察過表達(dá)Wnt11和加入BMP2協(xié)同誘導(dǎo)對(duì)BM-MSCs向心肌樣細(xì)胞分化的生物學(xué)效應(yīng)。
　　 根據(jù)不同誘導(dǎo)條件，培養(yǎng)細(xì)胞分為7組：陰性對(duì)照組( BM-MSCs)、心肌細(xì)胞單純誘導(dǎo)組(CM)、心肌微環(huán)境下BMP2誘導(dǎo)組(CM+BMP2)、心肌微環(huán)境下Wnt11誘導(dǎo)組(CM+Wnt11)、Wnt11與BMP2協(xié)同誘導(dǎo)組(Wnt11+BMP

3、2)、心肌微環(huán)境下Wnt11與BMP2協(xié)同誘導(dǎo)組(CM+Wnt11+BMP2)、陽性對(duì)照組(heart)。
　　 誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后，分別應(yīng)用RT-PCR、免疫熒光化學(xué)染色等方法，檢測BM-MSCs心肌特異性轉(zhuǎn)錄因子(NKX2.5、GATA4、Mef2c)和成熟心肌細(xì)胞特異性基因(cTnI、ANP、α-MHC、β-MHC)的核酸表達(dá)，分析Wnt1l協(xié)同BMP-2在心肌細(xì)胞旁分泌作用下對(duì)BM-MSCs向心肌細(xì)胞分化的影響。
　

4、　 結(jié)果：
　　 1．在體外成功進(jìn)行心肌細(xì)胞、BM-MSCs分離、純化、鑒定及擴(kuò)增，采用Transwell共培養(yǎng)體系模擬了“心肌”微環(huán)境的旁分泌作用，建立心肌細(xì)胞/BM-MSCs共培養(yǎng)的方法體系。
　　 2．與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組相比較，經(jīng)不同共平培養(yǎng)組誘導(dǎo)的BM-MSCs中α-MHC、β-MHC、NKX2.5表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0.05)；CM+WNT11+BMP2組心肌細(xì)胞特異性標(biāo)記GATA4、Mef2c、cTnI、A

5、NP的表達(dá)增強(qiáng)(P＜0．05)；組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。
　　 3.與BM-MSCs組及其他誘導(dǎo)組相比，CM+WNT11+BMP2組BM-MSCs其Nkx2.5、cTnI、β-MHC和α-MHC表達(dá)均顯著增加(P＜0.05)，誘導(dǎo)的BM-MSCs呈梭形及類似肌細(xì)胞樣形態(tài)。
　　 結(jié)論：
　　 1、Wnt11與BMP2協(xié)同作用可誘導(dǎo)BM-MSCs分化為心肌樣細(xì)胞。
　　 2、在“心肌”微環(huán)