miR-1介導(dǎo)Notch信號(hào)通路調(diào)控大鼠MSCs向心肌樣細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的和意義：
　　 移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)治療缺血性心肌病已成為一大熱點(diǎn)。研究表明肌特異性miR-1在調(diào)控細(xì)胞肌分化方面起著關(guān)鍵作用。Notch信號(hào)通路參與調(diào)控眾多細(xì)胞生命過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、凋亡和分化。有報(bào)道Notch信號(hào)通路與miRNAs之間相互作用，miRNAs調(diào)控Notch信號(hào)通路發(fā)揮生物學(xué)作用。基于此，我們假設(shè)轉(zhuǎn)導(dǎo)miR-1至大鼠MSCs內(nèi)并調(diào)控Notch信號(hào)通路來(lái)促

2、進(jìn)MSCs分化為心肌樣細(xì)胞，為缺血性心肌病的細(xì)胞治療提供可能。
　　 方法：
　　 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法從大鼠骨髓中獲得MSCs并觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞學(xué)鑒定MSCs；同時(shí)合成攜帶GFP過(guò)表達(dá)miR-1慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(MSCsmiR-1)，對(duì)照組只攜帶GFP；將過(guò)表達(dá)miR-1慢病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠MSCs并培養(yǎng)15天，光鏡下觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化；在第0、4、6、15天qRT-PCR檢測(cè)miR-1、心肌相關(guān)基因GATA-4

3、、α-actin、cTnI和Connexin43(Cx43)及Notch信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA的表達(dá)變化；免疫熒光觀察cTnI和Cx43的表達(dá)；Westernblotting檢測(cè)α-actin的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 原代細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、漩渦狀生長(zhǎng)，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示98％以上細(xì)胞表達(dá)CD44和CD29，1％以下表達(dá)CD45；與對(duì)照組相比，MSCsmiR-1組的miR-1的含量明顯增高；轉(zhuǎn)導(dǎo)miR-1后，MS

4、CsmiR-1組高表達(dá)心肌相關(guān)基因：包括GATA-4、α-actin、cTnI和Cx43；轉(zhuǎn)染4天后免疫熒光即可檢測(cè)cTnI和Cx43在MSCsmiR-1組的一些細(xì)胞中表達(dá)，并在第15天時(shí)表達(dá)最強(qiáng)；Westernblotting更進(jìn)一步證實(shí)了α-actin在MSCsmiR-1組中的表達(dá)。觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)前后Notch信號(hào)通路基因的mRNA水平變化發(fā)現(xiàn)，miR-1通過(guò)調(diào)控配體Jagged1來(lái)促進(jìn)分化；Jagged1的mRNA水平下調(diào)負(fù)性調(diào)控MSC

5、s的肌細(xì)胞分化過(guò)程，同時(shí)我們觀察到了Notch1、Notch3和Hey2的mRNA水平下調(diào)，這說(shuō)明，miR-1促進(jìn)的肌分化過(guò)程伴隨著Notch信號(hào)通路的Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2mRNA水平的顯著下調(diào)Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2是肌分化過(guò)程中Notch信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，這也許可以用來(lái)調(diào)控干細(xì)胞命運(yùn)。
　　 結(jié)論：
　　 轉(zhuǎn)導(dǎo)miR-1至大鼠MSCs中可促使其向心肌樣細(xì)胞