Jagged1介導(dǎo)的Notch信號(hào)通路激活誘導(dǎo)大鼠肝移植術(shù)后膽管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變的研究.pdf

1、目的：探討Jagged 1/Notch 信號(hào)通路誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變在大鼠肝移植術(shù)后損傷膽管上皮細(xì)胞中的作用研究。
　　 方法：1）96只清潔級(jí)、雄性健康SD 大鼠隨機(jī)分成3組，A組；肝移植組（48只），B組；假手術(shù)組（24只，開腹肝臟游離，不損傷血管和膽管）和C組；正常對照組（24只）。采用改良Kamada 原位“二袖套”法建立大鼠肝移植模型，大鼠隨機(jī)分成受體組和供體組，受體體重略大于供體體重，供、受體肝動(dòng)脈結(jié)扎，不吻合。分別

2、于術(shù)后1d、7d、14d和28d 采集靜脈血檢測總膽紅素（TBIL）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），同一時(shí)間點(diǎn)處死大鼠取肝組織，蘇木素-伊紅染色（HE）觀察三組大鼠肝臟病理學(xué)改變，免疫組織化學(xué)定位和免疫印跡（western-blot）法檢測肝組織Notch 信號(hào)配體Jagged1、靶基因Hes1，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1（FSP-1）、波形蛋白（vimentin）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）和膽管

3、細(xì)胞特異性標(biāo)記角蛋白19片段（CK19）的表達(dá)。2）體外分離培養(yǎng)SD 大鼠原代肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞(rIBECs)，錐蟲藍(lán)拒染檢測活性、免疫細(xì)胞化學(xué)（CK19）鑒定細(xì)胞。構(gòu)建pEGFPIRES2-Jagged 1 真核表達(dá)載體并Lipofectamine TM2000 轉(zhuǎn)染原代肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，設(shè)轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染+Notch 信號(hào)抑制劑DAPT 處理組(劑量為：1μmol/L)、空載體組、未處理組。western-blot 法檢測四組細(xì)胞Jag

4、ged 1 蛋白、Hes1 蛋白，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白（FSP-1，vimentin，α-SMA）和CK19 蛋白的表達(dá)。倒置顯微鏡觀察四組膽管細(xì)胞的形態(tài)，transwell 小室法檢測四組細(xì)胞的遷移侵襲能力。
　　 結(jié)果：
　　 1)成功建立大鼠原位肝移植模型，受體大鼠術(shù)后正常條件下喂養(yǎng)存活良好。術(shù)后肝功能檢測，肝移植組大鼠淤膽明顯，TBIL(32.05±3.28μmol/L),γ-GT(118.3±17.4μmol/L)

5、升高顯著，尤以術(shù)后14d 升高明顯，術(shù)后28d出現(xiàn)下降。蘇木素-伊紅染色（HE）顯示肝移植組術(shù)后門脈匯管區(qū)損傷膽管呈明顯的小膽管反應(yīng)改變；膽管擴(kuò)張、膽管細(xì)胞增生、膽管細(xì)胞數(shù)量增多、纖維組織增生、門脈匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤。免疫組化檢測：肝移植組術(shù)后增生膽管細(xì)胞的胞膜及胞漿陽性表達(dá)Jagged 1，Hes1，呈棕黃顆粒，且隨術(shù)后時(shí)間延長，棕黃色顆粒顏色加深，對照組Jagged 1，Hes1 弱表達(dá)于正常膽管，同時(shí)弱表達(dá)門脈匯管區(qū)、肝細(xì)胞胞膜以

6、及肝靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。肝移植組間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記FSP-1,vimentin，α-SMA 均陽性表達(dá)于增生顯著的膽管細(xì)胞，呈棕黃色顆粒，且隨術(shù)后時(shí)間延長，棕黃色顆粒顏色加深，同時(shí)增生膽管細(xì)胞陰性表達(dá)CK19。Western-blot 檢測：對照組肝組織Jagged 1 蛋白、Hes1 蛋白低表達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白（FSP-1，vimentin，α-SMA）低表達(dá)，CK19 蛋白高表達(dá)。術(shù)后7d 肝移植組Jagged 1，Hes1，F(xiàn)SP-1，vi

7、mentin，α-SMA 均出現(xiàn)高表達(dá)，且隨術(shù)后時(shí)間延長，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，CK19 蛋白表達(dá)明顯減弱。
　　 2)轉(zhuǎn)染Jagged 1 載體大鼠肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞Jagged 1 蛋白、Hes1 蛋白高表達(dá)，伴隨間質(zhì)標(biāo)記蛋白（FSP-1,vimentin，α-SMA）高表達(dá)，CK19 蛋白低表達(dá)，DAPT 處理組、空載組和未處理組Jagged 1 蛋白、Hes1 蛋白低表達(dá)，且間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白（FSP-1，vimentin,α-SM

8、A）低表達(dá)，而CK19 蛋白高表達(dá)。轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的形態(tài)呈梭形樣改變，其余三組細(xì)胞為鵝卵石樣細(xì)胞形態(tài)。transwell 小室檢測細(xì)胞遷移侵襲能力發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組遷移細(xì)胞(21333±520)與其余三組遷移細(xì)胞(2083±381，2000±661,1833±389)差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：改良Kamada 原位“二袖套”大鼠肝移植術(shù)后早期（≤4w），損傷膽管呈小膽管反應(yīng)改變，該過程中Jagged 1 激活的Notch 信號(hào)