膽管周圍血管叢微循環(huán)障礙對大鼠移植肝膽管上皮細(xì)胞影響的研究.pdf

1、自1967年Thomas E.Starzl成功實施首例肝移植(Liver Transplantation，LTx)以來，歷經(jīng)近40年發(fā)展，目前LTx已成為終末期肝病最為有效的治療手段。隨著臨床LTx的發(fā)展，術(shù)后長期生存的病例不斷增多，但肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的發(fā)生率仍徘徊在5.8％～24.5％，與膽道并發(fā)癥相關(guān)的病死率為6.0％～12.5％。因此處理好LTx術(shù)后膽道并發(fā)癥對提高肝移植患者的長期生存率及生活質(zhì)量具有非常重要意義。 但

2、是，直至目前，發(fā)生移植后膽管并發(fā)癥的確切病因及發(fā)病機制尚不十分清楚?？赡芘c多種因素有關(guān)，包括缺血性膽管損害(ischemia-type biliary lesions，ITBL)、免疫性膽管損害及感染性膽管損害。目前ITBL被認(rèn)為是非外科性移植物膽管樹損害的主要原因。ITBL的發(fā)病可能涉及以下幾個方面：(1)冷保存-再灌注對膽管壁組織的直接損傷；(2)膽管微血管床的損傷；(3)移植物動脈化延遲造成的膽管熱缺血損傷；(4)疏水性膽鹽對膽管

3、上皮細(xì)胞的毒性作用。 目前的研究表明，肝內(nèi)膽管的血供主要來自于肝動脈。肝內(nèi)膽管則由左右肝動脈分支形成的非軸性動脈網(wǎng)供血，在匯管區(qū)內(nèi)與門靜脈分支伴行。肝動脈的終末端與門靜脈終末端的分配靜脈同時分成更細(xì)小的微血管，并與血竇相聯(lián)。 膽管組織，尤其是膽管上皮細(xì)胞更易受冷保存一再灌注及肝動脈缺血損傷，具體原因目前尚不十分清楚。近年來，微循環(huán)及其血管內(nèi)皮細(xì)胞在冷保存-再灌注損傷中的作用越來越引起研究者的重視。已有研究表明，冷保存-再

4、灌注可引起肝、腎等組織器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和微循環(huán)障礙，從而進一步加重組織的缺血-再灌注損傷。由此可以推測，膽管內(nèi)皮細(xì)胞及其周圍膽管血管叢在膽管冷保存-再灌注損傷以及膽管周圍血管叢的微循環(huán)缺血的病理生理過程中起著至關(guān)重要的作用。也可能是供肝長時間冷保存后易造成肝移植術(shù)后膽管組織嚴(yán)重?fù)p傷和ITBL發(fā)生的重要原因之一。 本課題將在建立大鼠肝臟原位移植模型的基礎(chǔ)上：①建立肝臟移植術(shù)后肝內(nèi)膽管周圍血管叢微循環(huán)障礙動物模型；②探討肝內(nèi)膽

5、管周圍血管叢微循環(huán)障礙對膽管上皮細(xì)胞的影響；③探討外源性r-VEGF<,165>對研究微循環(huán)障礙在移植肝膽管上皮細(xì)胞損傷中的作用，以及對膽管周圍血管叢微循環(huán)障礙時所致的的肝內(nèi)膽管及管周血管叢損傷是否具有保護作用，以期進一步闡明移植肝膽管上皮細(xì)胞損傷的發(fā)生機制，為臨床肝移植術(shù)后ITBL的防治提供理論參考。方法與結(jié)果：1、實驗動物SD大鼠采用改良Gao's大鼠肝臟移植手術(shù)方式重建肝動脈。在此肝臟移植實驗的基礎(chǔ)上，將各組實驗動物按照給予不同干

6、預(yù)因素再隨機分為三個實驗組，于首次手術(shù)后3天行二次手術(shù)：A組：肝動脈結(jié)扎(HAL)組。包括A1：UW液保存2h；A2：8h；A3：16h；B組：肝動脈微球注射+肝動脈結(jié)扎(MS+HAL)組，C組：對照(S0)組，同樣分亞組。設(shè)術(shù)后3d、7d兩個時相點，每一時相點6對大鼠。選取P8組進行了組織病理學(xué)觀察及評分：移植術(shù)后HAL組膽管損傷、肝小葉壞死、較SO組嚴(yán)重，而MS+HAL組則更加嚴(yán)重，統(tǒng)計學(xué)比較有顯著性差異(P<0.05)。

7、2．對第一部分實驗標(biāo)本行免疫組化檢測，結(jié)果表明PCNA、CK-19、F-Ⅷ-Ag、VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFR-2、VEGFR-3均有蛋白表達，其中2h表達最強，16h表達最弱，8h介于二者之間，并且7d均高于3d。同組內(nèi)不同時間段或同一時間段不同亞組間比較，僅少數(shù)無顯著性差異。 VEGFR-1則無蛋白表達。選取P2h亞組作RT-PCR顯示，各亞組均有VEGF及其受體的mRNA表達，相對密度比值顯示同組內(nèi)不同時間段或同

8、一時間段不同亞組間比較，僅少數(shù)無顯著性差異。并且7d均高于3d。 3．在第一部分的二次手術(shù)基礎(chǔ)上，選取P8h組，在給予不同干預(yù)措施的同時給予r-VEGF<,165> 2ml(2.5ng/ml)腹腔注射，每日2次，同樣取術(shù)后3d、7d時間段，每時段每組6只動物。組織病理學(xué)觀察及評分：移植術(shù)后各實驗組組膽管損傷、肝小葉壞死、較對照組組減輕，統(tǒng)計學(xué)比較有顯著性差異(P<0.05)。免疫組化檢測PCNA、CK-19、F-Ⅷ-Ag、VEG

9、FA、VEGFB、VEGFC、VEGFR-2、VEGFR-3均有蛋白表達，其中實驗組P8HALV組表達最強，對照組P8MSHAL組表達最弱，其余各組介于二者之間，并且7d均高于3d。同組內(nèi)不同時間段或同一時間段不同亞組間比較，僅少數(shù)無顯著性差異。VEGFR-1仍無蛋白表達。RT-PCR顯示，各亞組均有VEGF及其受體的mRNA表達，相對密度比值顯示同組內(nèi)不同時間段或同一時間段不同亞組間比較，僅少數(shù)無顯著性差異。并且7d均高于3d。

10、 結(jié)論： 1．成功建立的大鼠肝臟移植術(shù)后膽管周圍血管叢微循環(huán)障礙動物模型，是研究肝臟移植術(shù)后膽管周圍血管叢微循環(huán)缺血對膽管上皮細(xì)胞的影響的較理想模型； 2．大鼠肝臟移植術(shù)后膽管周圍血管叢微循環(huán)缺血可刺激膽管上皮細(xì)胞過度表達VEGFA、VEGFB、VEGFC及其受體VEGFR-2、VEGFR-3蛋白；其可以改善膽管周圍血管叢微循環(huán)缺血，并誘導(dǎo)膽管周圍血管叢的增生，進而促進膽管上皮細(xì)胞的修復(fù)； 3．外源性r-VEG