移植肝膽管細(xì)胞膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膽管損傷中的作用實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究背景
　　 膽道并發(fā)癥仍然是嚴(yán)重影響肝移植受者生活質(zhì)量及長期生存率的并發(fā)癥之一。隨著外科技術(shù)的進(jìn)步,吻合口狹窄等并發(fā)癥呈逐漸下降的趨勢,而非吻合口并發(fā)癥,如缺血型膽道病變,則成為肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的主要臨床病理表現(xiàn)。
　　 肝臟移植術(shù)后缺血型膽道病變的發(fā)生機(jī)制尚不明確,目前,學(xué)者普遍認(rèn)為與膽道缺血、免疫等因素有關(guān)。近年來,越來越多的研究表明膽汁中膽鹽/磷脂比升高在肝移植后膽管損傷中起著重要作用。然而,肝移植后膽

2、鹽/磷脂比升高引起膽管及其上皮細(xì)胞損傷的具體機(jī)制尚無研究報(bào)道。研究表明,膽鹽除了有“去污作用”外,還可在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮信號(hào)分子的作用,參與細(xì)胞的增生和凋亡;而且由于其“去污作用”需要在高濃度下才能發(fā)揮,所以膽鹽以信號(hào)分子的角色參與膽管細(xì)胞的病理生理改變可能更為普遍。在生理情況下,膽管細(xì)胞可經(jīng)頂膜鈉依賴性膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(apicalsodium-dependent bile acid transporter,ASBT)進(jìn)行膽汁酸的重吸收,由細(xì)胞

3、內(nèi)膽汁酸結(jié)合蛋白(ileal bile acid binding protein,IBABP)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞基底側(cè),并經(jīng)有機(jī)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體α/β(organic solute transporter alpha/beta,Ostα/β)等轉(zhuǎn)出至門脈系統(tǒng),從而啟動(dòng)了膽汁酸的“膽肝循環(huán)”。平衡的“膽肝循環(huán)”不會(huì)引起膽鹽在細(xì)胞內(nèi)潴留,這也是膽管細(xì)胞對膽鹽毒性的一種自我保護(hù)機(jī)制。研究表明在多種炎癥性及代謝性疾病中,膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)發(fā)生改變,引起膽汁酸

4、轉(zhuǎn)運(yùn)的紊亂,從而參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。據(jù)以上觀點(diǎn)和現(xiàn)象,我們推測,在移植肝冷保存再灌注損傷時(shí),由于炎癥因子的作用及核受體(如類法尼醇受體)表達(dá)/功能的改變,膽管細(xì)胞的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)平衡可能受到破壞,導(dǎo)致膽管細(xì)胞對膽鹽毒性的自我保護(hù)功能紊亂,膽鹽在膽管細(xì)胞內(nèi)聚集,從而引起膽管細(xì)胞的損傷。
　　 二、研究目的
　　 基于以上假設(shè),本研究以同系大鼠肝移植模型為研究對象,探討移植肝膽管細(xì)胞膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在膽管損傷中的作用,并利用體外培

5、養(yǎng)的膽管研究類法尼醇受體(Farnesoid X receptor,FXR)對膽管細(xì)胞膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響,探討肝移植后膽管細(xì)胞膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與膽管細(xì)胞損傷的機(jī)制。
　　 三、研究方法及結(jié)果
　　 1.利用免疫組織化學(xué)檢測肝組織中ASBT、IBABP、Ostα及Ostβ的表達(dá)分布,結(jié)果顯示,ASBT表達(dá)于大膽管細(xì)胞頂側(cè)胞膜,IBABP表達(dá)于大膽管細(xì)胞漿,Ostα/Ostβ異二聚體表達(dá)于大、小膽管細(xì)胞基底側(cè)胞膜及肝細(xì)胞

6、血竇面胞膜。同時(shí),我們用Realtime PCR及Western blot方法檢測分離的大小膽管組織中ASBT、IBABP及Ostα/Ostβ的表達(dá),結(jié)果也顯示,大膽管組織中ASBT和IBABP的表達(dá)顯著高于小膽管,而Ostα/Ostβ在大膽管和小膽管組織中的表達(dá)量無顯著差異。
　　 2.我們從mRNA水平和蛋白水平檢測了移植肝膽管細(xì)胞膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)變化,并通過組織形態(tài)學(xué)觀察和細(xì)胞凋亡檢測評估移植肝膽管損傷的嚴(yán)重程度,結(jié)果顯

7、示,大鼠肝移植術(shù)后早期(術(shù)后1-3天)膽管細(xì)胞膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)均降低,降低幅度與供肝冷保存時(shí)間相關(guān)。隨后,位于細(xì)胞頂側(cè)的ASBT與位于胞漿內(nèi)的IBABP及基底側(cè)Ostα-Ostβ呈現(xiàn)不同的恢復(fù)速度及變化趨勢,即ASBT很快恢復(fù)到正常水平,且在術(shù)后第7天其表達(dá)水平顯著高于正常,而IBABP和Ostα-Ostβ表達(dá)長時(shí)間降低,直到術(shù)后第7天(短冷卻血組)甚至到第14天(長冷缺血組)才恢復(fù)到正常水平。ASBT與IBABP、Ostα和Osβ表

8、達(dá)水平的比值與大膽管損傷嚴(yán)重程度顯著相關(guān)。
　　 3.在檢測移植肝膽汁中膽汁酸和磷脂濃度變化情況的基礎(chǔ)上,我們通過免疫組織化學(xué)、熒光實(shí)時(shí)定量PCR、Western blotting及電泳移動(dòng)漂移實(shí)驗(yàn)等技術(shù),探討不同冷保存時(shí)間下移植肝FXR表達(dá)及功能變化,結(jié)果顯示,供肝冷保存再灌注損傷并不能引起膽汁中總膽汁酸的濃度的改變,只是通過降低磷脂的濃度,使膽汁酸/磷脂比增加,從而升高了膽汁中膽汁酸的相對濃度。大鼠肝移植后膽管組織中FXR的

9、表達(dá)及功能活性顯著降低,供肝冷保存時(shí)間越長,降低越明顯。
　　 4.通過分離培養(yǎng)SD大鼠肝內(nèi)膽管,探討FXR對與膽汁共培養(yǎng)的膽管細(xì)胞之膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果顯示,在正常膽管上皮細(xì)胞中,毒性膽汁可促進(jìn)ASBT、IBABP、Ostα及Ostβ的表達(dá)均增加;而在轉(zhuǎn)染了FXR shRNA的膽管細(xì)胞中,毒性膽汁可同樣升高ASBT的表達(dá),而IBABP、Ostα和Ostβ的表達(dá)并未增加,反而下降。
　　 四、結(jié)論