促磷脂分泌對(duì)大鼠移植肝膽管損傷的防治作用研究.pdf

1、一.目的
　　 膽道并發(fā)癥嚴(yán)重影響肝移植受體的生存及生活質(zhì)量,被公認(rèn)為肝臟移植的薄弱環(huán)節(jié)(Achilles'heel)。隨著人們對(duì)膽道并發(fā)癥認(rèn)識(shí)的深化和外科吻合技術(shù)的提高,由外科技術(shù)原因造成的膽管吻合口并發(fā)癥及引流管相關(guān)性并發(fā)癥的發(fā)病率呈下降趨勢(shì),而以非外科技術(shù)因素所導(dǎo)致的膽道并發(fā)癥仍然是制約肝臟移植遠(yuǎn)期療效的主要因素之一。以彌漫性或局灶性的移植物膽管樹狹窄、擴(kuò)張、毀損及管型形成為病理特征的缺血型膽管病變(ITBL)是非外科性移

2、植物膽管并發(fā)癥的主要類型[1],發(fā)生率為2％-19％。盡管公認(rèn)冷保存/再灌注損傷(CPRI)是其發(fā)病的主要原因,但具體機(jī)制尚不清楚。近年來,疏水性膽鹽在膽道損傷中的作用受到人們的重視。疏水性膽鹽既可以通過“去垢”作用干擾生物膜的脂代謝,也可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性[2]。人的膽鹽池95％以上由疏水性膽鹽組成。在正常情況下,人體具有一套中和疏水性膽鹽細(xì)胞毒性的自我保護(hù)機(jī)制,如磷脂可以與膽鹽形成微膠粒(micelle)以降低其細(xì)胞

3、毒性、膽汁所含的親水性膽鹽可以通過增強(qiáng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性來對(duì)抗疏水性膽鹽的細(xì)胞毒性等等。此外,膽汁主要成份的分泌完全依賴于位于肝細(xì)胞毛細(xì)膽管面的肝膽膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HMTs),HMTs基因表達(dá)異常有可能導(dǎo)致膽汁淤積和膽管損傷。已經(jīng)有研究提示肝移植術(shù)后早期存在膽汁成份失衡的現(xiàn)象。綜合近年來國(guó)內(nèi)外的研究結(jié)果,“毒性膽汁”假說在移植肝冷保存/再灌注膽管損傷中的作用日益受到重視。因此我們提出如下設(shè)想:如果我們能對(duì)膽汁的成分進(jìn)行主動(dòng)調(diào)控,增加膽汁中磷脂及

4、親水性膽鹽的比重,是否有助于中和疏水性膽鹽的細(xì)胞毒性、減輕移植肝膽管樹損傷呢?。
　　 3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑(辛伐他汀)因其對(duì)血脂的主要成份有明確作用,并有良好的危險(xiǎn)效益比,以及此類藥物獨(dú)特的降脂效益而應(yīng)用日趨廣泛。最近一些研究發(fā)現(xiàn),他汀類藥物對(duì)大鼠肝膽管磷脂的分泌有顯著性影響,5天以上的長(zhǎng)期治療可誘導(dǎo)肝磷酸卵磷脂(PC)的合成和促進(jìn)膽汁磷脂的排出,但對(duì)膽鹽的分泌沒有影響[3]。
　　

5、 疏水性膽鹽具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,在膽管損傷中扮演著重要角色。主動(dòng)改變膽汁的成份,防止膽鹽對(duì)肝細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用,有著重要的現(xiàn)實(shí)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究擬以探索這一防治策略為主要目的,建立一種適用于移植肝膽道問題研究的大鼠肝移植模型,探討經(jīng)歷CPRI后移植肝膽汁主要成份的變化規(guī)律及與膽管損傷的相關(guān)性,并對(duì)磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)及功能變化進(jìn)行研究,為臨床上移植肝膽道并發(fā)癥的防治提供新的思路。
　　 二、方法
　　

6、 為了驗(yàn)證我們的假想,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下:首先,建立重建肝動(dòng)脈的大鼠肝移植模型,設(shè)置辛伐他汀喂飼(實(shí)驗(yàn)組)、標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)(對(duì)照組)和假手術(shù)組,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組供體肝臟經(jīng)歷UW液12小時(shí)保存后植入受體,于術(shù)后14天獲取大鼠肝臟、血液及膽汁標(biāo)本;隨后,應(yīng)用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)膽汁標(biāo)本中膽鹽的成份及變化情況,并進(jìn)一步分析膽汁和血清中磷脂(PL)和總膽汁酸(TBA)的變化情況,評(píng)價(jià)經(jīng)過辛伐他汀處理后,移植肝大鼠的膽汁成份變化情況;然后,觀

7、察肝臟組織的病理學(xué)變化,并探討這些變化與膽汁磷脂分泌之間的關(guān)系;最后,應(yīng)用免疫組織化學(xué)和實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)變化,探討辛伐他汀對(duì)大鼠移植肝磷脂變化的作用機(jī)制。
　　 三、結(jié)果
　　 1.動(dòng)脈化的重建肝動(dòng)脈的大鼠原位肝移植模型適合應(yīng)用于膽道并發(fā)癥的研究,具有較好的操作性和可重復(fù)性;
　　 2.經(jīng)辛伐他汀處理后大鼠膽汁中磷脂成份明顯增加,與假手術(shù)組和對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);對(duì)膽

8、汁中膽鹽成份沒有影響,間接的降低了膽汁中膽鹽/磷脂的比值,減輕了這一造成移植肝膽管損傷因素的作用;
　　 3.術(shù)后辛伐他汀處理組大鼠的血清膽系酶譜(r-GT、ALP)顯著降低,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);并且這一變化趨勢(shì)與膽汁中磷脂的分泌呈負(fù)相關(guān);
　　 4.肝臟組織HE、Masson染色發(fā)現(xiàn),對(duì)照組肝臟組織炎癥反應(yīng)明顯,膽管損毀嚴(yán)重,并伴有大量的膽管增生;而辛伐他汀處理組的病理學(xué)變化則較對(duì)照組輕微;
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9、.免疫組織化學(xué)方法顯示磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Mdr2 P-糖蛋白)在大鼠肝細(xì)胞膜上的表達(dá)辛伐他汀處理組較對(duì)照組有明顯增強(qiáng),主要位于匯管區(qū)及門靜脈周圍區(qū)域;假手術(shù)組大鼠Mdr2 P-糖蛋白僅有微弱表達(dá);
　　 6.Taqman探針法實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Mdr2 mRNA的表達(dá)在辛伐他汀處理組大鼠中辦有顯著增強(qiáng),且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 四、結(jié)論
　　 1.辛伐他汀能有效的增加大鼠移植術(shù)后膽汁中磷脂成份的分泌,