多烯磷脂酰膽堿對大鼠肝移植術中膽道相對熱缺血再灌注損傷的保護作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目前肝移植已成為治療終末期肝病的最佳手段。肝移植術后的膽道并發(fā)癥作為制約移植受體存活率和遠期療效的關鍵,素來有“阿喀琉斯之踵”之稱。缺血再灌注損傷是供肝膽管必須經歷的病理生理過程,也是導致移植術后膽道并發(fā)癥的主要因為之一。移植肝膽管要經歷短暫的熱缺血、冷保存損傷、相對熱缺血再灌注損傷、再灌注損傷。其造成膽道損傷的機理可能包括細胞線粒體呼吸功能喪失以及繼發(fā)于ATP耗竭的能量依耐性代謝通路和轉運功能衰竭、膽管上皮細胞骨架蛋白受損,有序的聚合

2、、解聚功能破壞以及膜轉運蛋白內部化所致。目前,肝移植術后早期的膽汁成分改變在膽道損傷中的作用越來越被人所重視。國內有關移植肝早期的膽汁成分變化的報道中涉及其因為的包括有:熱缺血、相對熱缺血、冷保存時間過長等,這些都會導致膽汁中膽鹽/磷脂比例改變,這種改變主要表現(xiàn)為比值增加,增加了膽汁毒性,是移植肝膽道損傷的重要發(fā)病機制之一。因此,探討肝移植術后早期膽汁成分變化,并針對其進行干預處理,對于指導臨床預防及治療肝移植術后膽道損傷,降低肝移植術

3、后膽道并發(fā)癥發(fā)生率具有十分重要的意義。多烯磷脂酰膽堿化學結構與內源性磷脂相同但在功能上因其含有必需的多價不飽和脂肪酸(亞油酸、亞麻酸和油酸)而優(yōu)于后者,可減少自由基攻擊,降低脂質過氧化損傷。而且,還可分泌入膽汁以穩(wěn)定膽汁。我們推測,如果予以多烯磷脂酰膽堿補充磷脂可能能夠減輕膽汁毒性,從而減輕膽管損傷。
   目的
   本研究采用大鼠自體原位肝移植模型,應用多烯磷脂酰膽堿進行處理,以膽汁中總膽汁酸(total bile

4、acid,TBA)濃度、磷脂(phospholipid,PL)濃度、TBA/PL并留取膽道標本以檢測組織病理學、透射電鏡檢查、膽汁堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)及谷氨?;D移酶(glutamyl transferase,γ-GT)水平為觀察參數(shù),探討多烯磷脂酰膽堿對大鼠肝移植術中相對熱缺血(relative warm ischemiatime,RWIT)造成膽道損傷的保護作用。為臨床合理有效地預防肝移植術中

5、RWIT造成膽道損傷提供理論依據。
   方法
   1.手術過程和動物分組
   健康、成年、SPF級純系SD大鼠72只(南方醫(yī)科大學實驗動物中心),雌雄不限,體重280~300g。大鼠常規(guī)飼養(yǎng),術前禁食8h,不禁水。按如下步驟進行手術操作:①0.3%戊巴比妥30mg/kg腹腔注射麻醉,麻醉成功后將肝臟完全游離。在十二指腸上方橫斷膽總管,近端插入硬膜外導管并結扎固定,以備建立膽道外引流通道。②穿刺腹主動脈及門靜

6、脈(portal vein,PV),并使之肝素化。③采用輸液泵行腹主動脈及門靜脈雙重冷灌注,分別灌注4℃含肝素(12.5U/ml)的乳酸林格氏液20ml,速度為2.5ml/min,于肝下下腔靜脈建立灌注液流出道。灌注同時用4℃乳酸林格氏液澆注肝臟表面降溫。④灌注完成后修補門靜脈、腹主動脈穿刺點以及肝下下腔靜脈流出道,恢復門靜脈灌注,結束無肝期。根據各組預定的膽道相對熱缺血時間,分別依次松開門靜脈、肝上下腔靜脈、肝下下腔靜脈、肝動脈的血管

7、夾使肝臟復流,恢復肝動脈的血液灌注。⑤建立膽道外引流通道:用截取自氣管插管氣囊的軟塑料充氣導管將膽總管插管及上段空腸造瘺相連接,建立膽道外引流模型。
   將大鼠隨機分成3組,對照組(A組),24只,供肝冷灌注結束后,將門靜脈(PV)、肝動脈(hepatic artery,HA)同時開放恢復血流灌注。相對熱缺血組(B組),24只,相對熱缺血60min組。PV開放恢復血流灌注后60min后再開放肝動脈HA。干預組(C組),24只,

8、PV、HA開放時間同B組,并于術前6h腹腔注射多烯磷脂酰膽堿注射液,并于術后每日腹腔注射多烯磷脂酰膽堿注射液。檢測各組術后2h及術后第1、3、5天膽汁中總膽汁酸(TBA)濃度、磷脂(PL)濃度、TBA/PL值并留取膽道標本以檢測組織病理學、透射電鏡檢查、膽汁堿性磷酸酶(ALP)及谷氨酰基轉移酶(γ-GT)水平作為檢測膽管損傷的指標。
   2.檢測方法
   (1)總膽汁酸鹽(TBA)及磷脂(PL)測定:TBA測定采用循

9、環(huán)酶法,試劑盒購自寧波賽克生物技術有限公司;PL檢測采用酶比色法,試劑盒購自北京金豪制藥有限公司。按照試劑盒說明書進行操作。(2)堿性磷酸酶(ALP)及谷氨?;D移酶(γ-GT)水平測定:處死大鼠前采集膽汁,用標準方法檢測膽汁中ALP及γ-GT(南方醫(yī)院檢驗中心)。(3)膽道組織病理分析:常規(guī)制作切片,石蠟包埋后,均勻切片至每片4μm,每個蠟塊組織切3張切片,HE染色后光鏡下觀察。病理結果量化評估:按以下標準對膽管損傷程度進行評分:膽管

10、粘膜上皮細胞和粘膜下腺體上皮細胞正常記0分;損傷局限在粘膜上皮層,膽管粘膜上皮細胞有散在性固縮、壞死、脫落,其數(shù)量不足粘膜上皮細胞總數(shù)的10%,粘膜下腺體正常記1分; 10%-30%的膽管粘膜上皮細胞固縮、壞死、脫落,10%以下的粘膜下腺體上皮細胞變性、壞死、脫落記2分;超過30%的膽管粘膜上皮細胞壞死、脫落,10%-30%的粘膜下腺體上皮細胞變性、壞死、脫落記3分。(4)透射電鏡檢查:將標本戊二醛液固定2h后,依次經過1%四氧化鋨固定

11、、梯度乙醇脫水、EPON812環(huán)氧樹脂浸泡包埋并超薄切片、醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色。
   3.結果判定
   放大倍數(shù)×8000,Imagepro圖像分析軟件行體視學形態(tài)定量分析,采用2個指標定量,(1)線粒體腫脹程度,表現(xiàn)線粒體受損情況,以所有線粒體平均體積(MITv)表示;(2)膽管上皮細胞表面微絨毛覆蓋面積,以膽管上皮細胞微絨毛的面積密度(Amv)表示。
   4.統(tǒng)計學處理
   計量資料用(x

12、)±s表示,數(shù)據用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析,多組均數(shù)間比較采用析因設計的方差分析,組間兩兩比較采用最小差異t檢驗(LSD-t)。相關性分析若滿足正態(tài)分布則采用Pearson相關檢驗,如不滿足正態(tài)分布則采用Spearman相關檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
   統(tǒng)計結果:
   (1)膽汁中TBA、PL濃度及TBA/PL值的變化
   ①A組術后TBA、PL及TBA/PL均穩(wěn)定,未出現(xiàn)顯著變化;

13、②TBA濃度:在術后2h時間點,B、C組顯著低于A組(F=29.91,P<0.01),并逐漸升高,到第3天各組之間TBA濃度已無顯著差異(F=1.84,P>0.05)。③PL濃度:B組術后下降顯著,此后緩慢升高,至術后第5天仍遠低于A組(P<0.01)。C組術后2h也出現(xiàn)下降,但高于B組(P<0.01),此后緩慢升高,在第5天與A組已無顯著差異(P>0.05)。④TBA/PL值:在術后2h時間點B組顯著高于A組,并于術后逐漸升高,至術后

14、第3天達到最高,術后第5天開始下降。C組術后未出現(xiàn)明顯變化,在各個時間點A、C組之間比較無差異(P>0.05)。
   (2)膽汁ALP和γ-GT水平
   ①ALP水平:A組最低,C組次之,B組最高,組間兩兩比較有統(tǒng)計學意義(F=33.83,P<0.01)。
   ②γ-GT水平:A組最低,C組次之,B組最高,組間兩兩比較有統(tǒng)計學意義(F=55.41,P<0.01)。
   (3)膽道組織病理評估

15、>   病理形態(tài)學改變主要為膽管粘膜上皮細胞有散在性固縮、壞死、脫落及粘膜下腺體上皮細胞變性、壞死、脫落,以術后第3天病理形態(tài)學改變最為明顯。其中,A組(對照組)僅偶見膽管上皮細胞固縮,無明顯異常; B組(相對熱缺血組)膽管上皮細胞大部分固縮,壞死,組織學改變程度最重;C組(干預組)出現(xiàn)部分膽管上皮細胞固縮,壞死,組織學改變輕于B組;A、B、C組間膽管上皮細胞病理形態(tài)學評分比較有統(tǒng)計學意義(F=1.98.00,P<0.01)。

16、   (4)膽管上皮細胞透射電鏡觀察
   膽管上皮細胞線粒體的形態(tài)改變:正常膽管上皮細胞微絨毛豐富,排列整齊,線粒體不腫脹,嵴清晰;A組膽管上皮絨毛排列尚整齊,未見明顯脫落,線粒體未見腫脹,嵴清晰,大致正常;B組可見膽管上皮細胞微絨毛大部分脫落,線粒體空泡變、嵴消失、部分膜破裂;C組可見膽管上皮細胞微絨毛排列稍紊亂,少部分脫落。線粒體稍腫脹,嵴模糊;膽道上皮細胞線粒體平均體積(MITv)的定量分析:三組間比較有統(tǒng)計學意義(F

17、=60.95,P<0.01)。膽道上皮細胞微絨毛的面積密度(Amv)的定量分析:B組最重,C組較輕,A組最輕,三組間比較有統(tǒng)計學意義(F=53.63,P<0.01)。
   (5)TBA/PL值與膽道損傷的相關性
   經過雙變量相關分析,得出膽汁中TBA/PL值與ALP水平、γ-GT水平、膽道病理形態(tài)學評分、線粒體平均體積均成顯著正相關(分別r=0.837、0.869、0.835、0.894,P<0.01),與膽道上皮

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