Trps1負向調控EMT對移植肝膽管纖維化的影響.pdf

1、一.背景:
　　非吻合口膽管狹窄(nonanastomotic biliary strictures,NABS)是目前肝移植術后膽道并發(fā)癥的主要類型,可導致進行性膽汁性肝硬化、移植物失功、再次肝移植及死亡,是制約肝移植療效進一步提高的瓶頸。其病理基礎是膽管上皮細胞(biliary epithelial cell,BEC)損傷后局部異常修復所致的移植肝膽管纖維化。研究發(fā)現(xiàn),移植肝膽管纖維化發(fā)生的獨立影響因素是冷保存再灌注損傷(col

2、d preservation reperfusion injury,CPRI),但其發(fā)病機制有待進一步闡明。
　　既往有關CPRI致移植肝膽管纖維化機制的研究主要側重于TGF-1誘導的肝星形細胞活化這一固有途徑。新近研究證實,BEC在細胞因子/促炎因子刺激下可通過上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)為成纖維細胞,是肝膽道纖維化過程中基質生成細胞的主要異質性來源。我們前期研究發(fā)

3、現(xiàn),BEC EMT是肝移植術后膽道纖維化狹窄的重要因素,提示若在BEC EMT這一關鍵環(huán)節(jié)進行干預,有可能抑制或逆轉移植肝膽管纖維化的進程。
　　上皮-間質轉化/間質-上皮轉化(epithelial-mesenchymal transition/mesenchymal-epithelial transition,EMT/MET)的平衡決定了創(chuàng)傷、炎癥組織修復的轉歸和結局,如果EMT發(fā)揮主要作用,修復將以纖維化告終,反之,纖維化可逆

4、轉為正常上皮。因此,通過抑制EMT、促進MET來減輕或逆轉創(chuàng)傷、炎癥組織的纖維化,已成為抗纖維化研究新的靶點。發(fā)鼻指(趾)綜合征1型相關基因(trichorhinophalangeal syndrome type1,Trps1)是胚胎期間充質細胞向上皮細胞轉分化的重要調控因子,對多種細胞EMT起關鍵的負向調控作用,而創(chuàng)傷、炎癥組織的修復過程是胚胎期多種上皮組織發(fā)育過程的再現(xiàn)。文獻報道Trps1在負向調控腎小管上皮細胞、肺泡上皮細胞EMT

5、及腎臟、肺纖維化中發(fā)揮關鍵作用,但其是否參與了移植肝膽管CPRI損傷后修復過程及其可能的機制目前尚不清楚。
　　二.目的:
　　通過檢測肝移植術后NABS患者病肝標本,離體和在體動物實驗證實Trps1參與肝移植術后NABS發(fā)生,通過對BEC EMT過程的關鍵負向調控作用,進而抑制移植肝膽管纖維化的進程。本研究有望拓寬對移植肝膽管纖維化發(fā)生機制的認識,為臨床肝移植術后NABS的防治提供新的策略,也將為損傷性膽管狹窄、肝膽管結石

6、病等相關疾病的理論研究和臨床診治提供新的線索。
　　三.方法和結果:
　　第一部分:NABS病肝標本中Trps1、上皮及間質標志物表達
　　采集肝移植術后NABS患者二次肝移植病肝標本6例,免疫組化方法檢測Trps1及上皮標志物(E-cadherin、CK19)、間質標志物(Vimentin、α-SMA)蛋白在BEC中的表達;Masson三色染色檢測膽管周圍膠原沉積。免疫組化及Masson染色結果均進行半定量分析。用肝

7、臟海綿狀血管瘤瘤體周邊正常肝膽管組織進行對照。采用直線回歸分析評估:(1)移植肝膽管Trps1與上皮標志物(E-cadherin、CK19)、間質標志物(Vimentin、α-SMA)表達水平相關性;(2)移植肝膽管纖維化程度與Trps1蛋白表達水平的相關性。
　　NABS組標本中BEC Trps1、上皮標志物(E-cadherin、CK19)表達下調或缺失,間質標志物(Vimentin、α-SMA)異常陽性表達,膽管周圍大量膠原

8、沉積;而對照組中上BEC Trps1、上皮標志物(E-cadherin、CK19)正常表達,間質標志物(Vimentin、α-SMA)陰性,膽管周圍僅見少量膠原沉積。免疫組織化學半定量分析顯示上述各種標志物在兩組中的表達水平差異顯著(P<0.05)。Mssson染色結果半定量分析顯示兩組標本膽管周圍膠原沉積水平差異顯著(P<0.05)。直線回歸分析顯示,Trps1與上皮標志物(E-cadherin、CK19)表達正相關(P<0.05),

9、而與間質標志物(Vimentin、α-SMA)表達負相關(P<0.05)。移植肝膽管纖維化程度與Trps1表達水平負相關(P<0.05)。
　　第二部分:離體實驗:Trps1在體外模擬CPRI誘導培養(yǎng)的HIBEC EMT中的作用
　　采用體外模擬 CPRI的方法處理人肝內膽管上皮細胞(human intrahepatic biliary epithelial cells,HIBECs P5100),電鏡下觀察細胞形態(tài),劃痕試

10、驗比較細胞運動能力, PCR檢測Trps1、上皮標志物(E-cadherin、CK19)與間質標志物(Vimentin、α-SMA) mRNA表達水平并做相關分析,Western blotting檢測上述標志物蛋白表達水平。分別利用Trps1腺病毒及Trps1 siRNA轉染HIBEC上調或下調內源性Trps1表達,重復CPRI誘導實驗,PCR及Western blotting檢測上皮標志物E-cadherin、間質標志物Vimenti

11、n mRNA及蛋白表達水平。
　　體外模擬CPRI處理HIBEC后,細胞形態(tài)由卵圓石樣或多邊形變?yōu)樗笮尉佣嗟某衫w維細胞樣,細胞運動能力明顯增強(P<0.05)。上皮標志物(E-cadherin、CK19)mRNA及蛋白表達減少(P<0.05),而間質標志物(Vimentin、α-SMA)mRNA及蛋白表達增加(P<0.05),BEC發(fā)生EMT。直線回歸分析顯示在此過程中Trps1 mRNA與上皮標志物(E-cadherin、CK1

12、9)mRNA表達正相關(P<0.05),而與間質標志物(Vimentin、α-SMA)mRNA表達負相關(P<0.05)。Trps1腺病毒轉染HIBEC后,細胞內Trps1 mRNA表達升高,重復上述CPRI誘導實驗,上皮標志物E-cadherin mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),而間質標志物Vimentin mRNA及蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),EMT效應被抑制; Trps1 siRNA轉染HIBEC后,細胞

13、內Trps1 mRNA表達降低,重復上述CPRI誘導實驗,上皮標志物E-cadherin mRNA及蛋白表達水平進一步降低(P<0.05),而間質標志物Vimentin mRNA及蛋白表達水平進一步升高(P<0.05),EMT效應加強。
　　第三部分:在體實驗:Trps1在SD大鼠原位肝移植術后膽管細胞EMT中的作用
　　建立重建肝動脈血供的SD大鼠原位肝移植模型,冷保存時間選擇1h、6h、12h,術后選擇1d、3d、7d、

14、14d四個時相點,采用Real-Time PCR定量檢測大鼠移植肝膽管Trps1、上皮標志物(E-cadherin、CK19)與間質標志物(Vimentin、α-SMA)mRNA表達水平,Western blotting檢測Trps1、上皮標志物E-cadherin、間質標志物Vimentin蛋白表達水平。
　　隨著供體肝臟冷保存時間延長,Trps1 mRNA及蛋白表達逐漸降低(P<0.05),上皮標志物(E-cadherin、C

15、K19)mRNA及蛋白表達逐漸降低(P<0.05)、間質標志物(Vimentin、α-SMA)mRNA及蛋白表達逐漸升高(P<0.05)。隨著術后時間延長,移植肝膽管上皮標志物(E-cadherin、CK19)mRNA及蛋白表達逐漸降低(P<0.05),間質標志物(Vimentin、α-SMA)mRNA及蛋白表達逐漸升高(P<0.05)。而Trps1表達先下調后上調,表現(xiàn)為術后1d Trps1 mRNA及蛋白表達降低,3d開始升高,至1

16、4d達到峰值。
　　四.結論:
　　1.Trps1參與肝移植術后NABS發(fā)病過程,并與BEC EMT及移植肝膽管纖維化負相關。
　　2.體外模擬CPRI可誘導HIBEC發(fā)生EMT,Trps1參與調控HIBEC EMT,發(fā)揮重要的拮抗作用并可能逆轉該過程。
　　3.SD大鼠肝移植術后,CPRI引起Trps1表達下調,進而誘導BEC發(fā)生EMT,在動物疾病模型上進一步證實Trps1是BEC EMT的關鍵負向調控因子。<