EMT機(jī)制在膽道閉鎖患兒膽管纖維化改變中作用的探討.pdf

1、目的：
　　 膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是嬰兒期引起膽汁淤積性黃疸的一種常見(jiàn)疾病，嚴(yán)重危及嬰幼兒生命。其發(fā)病率為1/14000～1/10000。臨床上常與新生兒特發(fā)性肝炎難鑒別。盡管隨著Kasai手術(shù)的廣泛開(kāi)展，使膽道閉鎖患兒獲得更多的生存機(jī)會(huì)，但在術(shù)后十年的生存率僅為10～20％，而且有70％～80％的患兒有進(jìn)行性的膽管破壞和肝纖維化，最終需要肝移植。BA病因至今尚不清楚，越來(lái)越多的人認(rèn)為圍生期病毒感染在

2、BA的發(fā)生中起重要作用，而病毒感染通過(guò)哪些途徑導(dǎo)致膽管進(jìn)行性炎癥、退化及肝纖維化目前尚不清楚。
　　 目前研究認(rèn)為在組織器官慢性纖維化中，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelium-mesenchymal transition，EMT）機(jī)制發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，EMT是指分化成熟的極化上皮細(xì)胞喪失上皮/內(nèi)皮細(xì)胞特征，向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使其具有更大的活性和遷移性，這一過(guò)程在胚胎發(fā)育、組織再生、組織器官纖維化、癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

3、生理狀態(tài)下，EMT是組織器官重要的創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制，組織器官損傷后通過(guò)EMT機(jī)制形成纖維瘢痕達(dá)到創(chuàng)傷修復(fù)，但這一過(guò)程持續(xù)存在則為病理狀態(tài)，可造成組織器官纖維化、硬化，這種轉(zhuǎn)化機(jī)制在毛細(xì)支氣管、腎小管等管狀組織纖維化中的研究較早、報(bào)道較多，而且最近EMT已經(jīng)成為終止、逆轉(zhuǎn)腎臟損傷后腎小管進(jìn)行性纖維化的重要治療靶點(diǎn)。最近有研究認(rèn)為EMT可能是參與BA中硬化性膽管炎的重要病理機(jī)制，在此過(guò)程中膽管上皮細(xì)胞逐漸喪失上皮細(xì)胞特性，并逐漸表現(xiàn)出間充質(zhì)細(xì)胞

4、特性，一系列重要的細(xì)胞因子CK-19、Fibronectin、TGF-β、Smad3和Hes-1等也參與了這一重要的病理過(guò)程。CK-19為膽管細(xì)胞特異性細(xì)胞因子，可直接反應(yīng)膽管上皮細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的變化；研究表明，F(xiàn)ibronectin為間充質(zhì)細(xì)胞特異性細(xì)胞因子，能直接影響細(xì)胞骨架成分的形成與組裝[7]，增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的粘附能力，在正常肝臟組織上皮類細(xì)胞中不表達(dá)，若在BA患兒肝臟上皮類細(xì)胞中表達(dá)，則可作為EMT機(jī)制激活的早

5、期信號(hào)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1是體內(nèi)作用最強(qiáng)和最廣泛的影響纖維產(chǎn)生的細(xì)胞因子[8]，通過(guò)TGF-β、smad信號(hào)通路使纖維化過(guò)程持續(xù)并進(jìn)一步惡化[9～10]；Hes-1為胚胎發(fā)育過(guò)程中Notch信號(hào)通路的重要下游信號(hào)，與先天性發(fā)育異常有密切關(guān)系，Hes-1的表達(dá)受Notch信號(hào)的調(diào)節(jié)[11]。但上述指標(biāo)在膽道閉鎖患兒肝臟組織膽管纖維化過(guò)程中是否起作用，又發(fā)揮著怎樣的作用等問(wèn)題目前仍不清楚。因此本文從膽管上皮細(xì)胞是否發(fā)生間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、是否

6、伴有纖維化等炎癥因子的參與、是否伴有胚胎發(fā)育信號(hào)的激活三方面綜合分析，對(duì)BA患兒膽管病理改變規(guī)律進(jìn)行深入研究，為進(jìn)一步探索新的治療方法奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究以經(jīng)手術(shù)證實(shí)為BA患兒的肝臟病理標(biāo)本和無(wú)肝膽系統(tǒng)畸形的同年齡段尸檢患兒肝臟標(biāo)本為研究對(duì)象，采用免疫組織化學(xué)染色方法觀察CK-19、Fibronectin、TGF-β1、Smad3和Hes-1在肝臟組織中表達(dá)和分布情況，探討EMT機(jī)制在BA中發(fā)揮的作用，了解BA早期患兒肝臟組

7、織膽管的病理變化規(guī)律，為深入了解BA患兒肝臟組織的病理演變規(guī)律提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、標(biāo)本制備及分組
　　 經(jīng)術(shù)前超聲、MRCP、術(shù)中所見(jiàn)、術(shù)中膽道造影證實(shí)為BA患者25例為病例組，術(shù)中無(wú)菌取活檢肝組織約0.5cmx0.5cmx0.5cm大小病理標(biāo)本，用4％多聚甲醛固定；對(duì)照組為無(wú)肝膽系統(tǒng)畸形的同年齡段尸檢患兒5例，取肝組織，并用4％多聚甲醛固定。
　　 二、免疫組織化學(xué)技術(shù)
　

8、　 應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)CK-19、Fibronectin、TGF-β、Smad3和Hes-1在對(duì)照組和病例組肝臟組織標(biāo)本中的分布和表達(dá)情況。
　　 三、數(shù)據(jù)分析
　　 采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以（）±s表示，數(shù)值比較采用t檢驗(yàn)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、膽管上皮細(xì)胞特異性細(xì)胞因子CK-19在BA組肝臟組織免疫組化染色中表達(dá)顯著，大量毛細(xì)

9、膽管增生，膽管失去正常管腔結(jié)構(gòu)，無(wú)固定形態(tài)，部分膽管上皮細(xì)胞表型喪失，形態(tài)不一，分布紊亂，且有膽汁淤積的膽管管腔結(jié)構(gòu)變化明顯，膽管上皮細(xì)胞形態(tài)變化嚴(yán)重。CK-19在病例組肝臟組織免疫組化染色中，平均膽管上皮陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（96.33±3.28個(gè)/HP），多于對(duì)照組（20.58±1.15個(gè)/HP），平均光密度為0.413±0.058，高于對(duì)照組0.264±0.02l，與對(duì)照組相比，P<0.001，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2、纖維化

10、早期指標(biāo)Fibronectin在BA組肝臟組織免疫組化染色中，肝細(xì)胞間、匯管區(qū)纖維組織及膽管上皮細(xì)胞均有表達(dá)，但在膽管上皮細(xì)胞表達(dá)顯著。Fibronectin在病例組肝臟組織免疫組化染色中，平均膽管上皮陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為57.24±2.08個(gè)/HP，多于對(duì)照組的0個(gè)/HP，P<0.001，病例組平均光密度為0.305±0.078高于對(duì)照組，對(duì)照組為0.093±0.001，P<0.001，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TG

11、F-β1在BA患兒肝臟組織免疫組化染色中染色部位廣泛分布于肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、門(mén)管區(qū)部分纖維結(jié)構(gòu)及周邊其它細(xì)胞內(nèi)，且肝細(xì)胞與周圍組織結(jié)構(gòu)染色更加明顯，較膽管上皮細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)烈。TGF-β1在病例組肝臟組織染色中，平均膽管上皮陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（85.16±2.65個(gè)/HP），多于對(duì)照組（20.25±1.78個(gè)/HP），平均光密度為0.396±0.030，高于對(duì)照組0.241±0.021，與對(duì)照組相比，P<0.001，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

12、　　 4、Smad3在BA患兒肝臟組織免疫組化染色中，肝細(xì)胞及膽管上皮細(xì)胞均存在，且膽管上皮細(xì)胞染色明顯強(qiáng)于肝細(xì)胞，匯管區(qū)血管平滑肌細(xì)胞亦可呈輕度染色。Smad3在病例組肝臟組織免疫組化染色中，平均膽管上皮陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（69.33±2.08個(gè)/HP），多于對(duì)照組（11.53±2.15個(gè)/HP），平均光密度為0.398±0.035，高于對(duì)照組0.254±0.028，與對(duì)照組相比，P<0.001，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5、He

13、s-1在BA患兒肝臟組織免疫組化染色中，膽管上皮細(xì)胞染色明顯強(qiáng)于對(duì)照組，染色主要位于細(xì)胞胞漿，較多上皮細(xì)胞表現(xiàn)為間充質(zhì)細(xì)胞表型，相鄰細(xì)胞之間相互融合，分布紊亂。Hes-1在病例組肝臟組織免疫組化染色中，平均膽管上皮陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（81.58±2.38個(gè)/HP），多于對(duì)照組（12.97±2.73個(gè)/HP），平均光密度為0.408±0.063，高于對(duì)照組0.231±0.015，與對(duì)照組相比，P<0.001，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)