BMSCs移植對(duì)UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響.pdf

1、第一部分、目的：采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)與純化Wistar大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并對(duì)其誘導(dǎo)成脂特性進(jìn)行鑒定，從而獲得足夠多的組織工程干細(xì)胞。
　　 方法：6 周齡清潔級(jí)雄性Wistar 大鼠，處死后，浸泡于75％酒精中15min，頭部露出。無(wú)菌條件下取兩側(cè)股骨和脛骨，去除骨表面附著的組織，用含10 萬(wàn)U/L 的青霉素和100ug/L 的鏈霉素的0.01M 的PBS 沖洗3-5 次，在無(wú)菌條件下，鉗掉骨端，將骨鉗成碎骨片，浸

2、于1×PBS中15min，最后經(jīng)單細(xì)胞濾網(wǎng)濾過(guò)，1500 轉(zhuǎn)，離心5min，棄上清，用含10％胎牛血清、10 萬(wàn)U/L 的青霉素和100ug/L 的鏈霉素的L-DMEM 培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，繼而按4×105 細(xì)胞/ml 的細(xì)胞密度接種到直徑10cm 的培養(yǎng)皿中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 小時(shí)后首次換液，去除漂浮的血細(xì)胞，以后每3 天更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70％-80％融合時(shí)，用0.25％胰酶消化傳代?？刂埔让傅牧考?/p>

3、消化時(shí)間，可以有效去除混雜細(xì)胞。取第三代bMSCs，置于成脂細(xì)胞誘導(dǎo)液中培養(yǎng)21 天后，行油紅O 染色鑒定。
　　 結(jié)果：bMSCs 以分散的克隆集落方式生長(zhǎng)，細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，高倍鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核橢圓形，有2～3 個(gè)清晰的核仁。經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)7d 后，細(xì)胞胞漿開(kāi)始出現(xiàn)脂滴。誘導(dǎo)培養(yǎng)21d 油紅O 染色后顯示細(xì)胞胞漿內(nèi)顆粒狀紅色脂滴形成。
　　 結(jié)論：采用全骨髓培養(yǎng)法，操作過(guò)程簡(jiǎn)單，可以獲得生長(zhǎng)狀態(tài)好、純度高的bMSCs，在特

4、定條件下培養(yǎng)，bMSCs 能夠向成脂細(xì)胞分化。
　　 第二部分，目的：觀察bMSCs 移植后對(duì)單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型大鼠腎臟組織病理、外周血及組織CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的影響，探討bMSCs移植后對(duì)間質(zhì)纖維化免疫抑制的作用。
　　 方法：自Wistar 大鼠分離bMSCs,經(jīng)體外傳代培養(yǎng)、成脂誘導(dǎo)及鑒定后制備細(xì)胞懸液。54 只Wistar 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(n=18)、bMSCs 注射組(bMSC

5、s 組,n=18)和生理鹽水注射組(NS 組,n=18)。bMSCs組和NS 組大鼠于UUO 模型建立的同時(shí)經(jīng)下腔靜脈分別注入bMSCs 和等體積生理鹽水。于建模后第3、7 和14 天分批處死大鼠并采集外周血及腎臟組織標(biāo)本，流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD4+CD25+Treg/CD4+Treg 比值，免疫組織熒光檢測(cè)腎臟組織Foxp3 表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：（1）與SH 組相比，建模后3 天、7 天、14 天時(shí)，bMSCs 組的CD

6、4+CD25+Treg/CD4+Treg 比值明顯增高（p<0.05)，但與NS 組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)；而NS 組與SH 組在3 天、7 天、14 天時(shí)亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）；
　　 （2）與SH 組相比，在第3、7 天時(shí)，bMSCs 組的腎臟病理結(jié)構(gòu)明顯得到改善；而在第14 天時(shí)兩組之間無(wú)顯著差異。
　　 (3）建模后3 天、7 天，bMSCs 組的腎組織Foxp3 相對(duì)表達(dá)水平明顯高于NS 組和

7、SH 組（p<0.05)，而14 天時(shí)三組之間差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。
　　 結(jié)論：（1）靜脈注入bMSCs 可以延緩UUO 模型大鼠腎臟間質(zhì)纖維化進(jìn)程，對(duì)腎臟有保護(hù)作用。
　　 （2）靜脈注入bMSCs 對(duì)UUO 的保護(hù)作用可能與foxp3+CD4+CD25+Treg在腎臟組織的局部浸潤(rùn)增加有關(guān)。
　　 第三部分: bMSCs 干預(yù)腎臟炎癥纖維化過(guò)程中對(duì)細(xì)胞因子的影響
　　 目的: 觀察b

8、MSCs 移植后單側(cè)輸尿管結(jié)扎（UUO）模型大鼠外周血及腎臟組織對(duì)細(xì)胞因子TGFβ、IL-10、IFN-γ的影響，探討bMSCs 移植后對(duì)腎臟保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　 方法: 自Wistar 大鼠分離bMSCs,經(jīng)體外傳代培養(yǎng)、成脂誘導(dǎo)及鑒定后制備細(xì)胞懸液。54 只Wistar 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對(duì)照組(n=18)、bMSCs 注射組(bMSCs 組,n=18)和生理鹽水注射組(NS 組,n=18)。bMSCs組和NS 組大鼠

9、于UUO 模型建立的同時(shí)經(jīng)下腔靜脈分別注入bMSCs 和等體積生理鹽水。于建模后第3、7 和14 天分批處死大鼠并采集外周血及腎臟組織標(biāo)本，用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）分別測(cè)定外周血及腎臟組織的細(xì)胞因子TGFβ、IL-10、IFN-γ的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果: 建模后3 天、7 天、14 天時(shí)，外周血上清液中，與NS 組、SH 組相比，bMSCs 組的IFNγ、IL-10 的表達(dá)水平均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）；而檢測(cè)T

10、GFβ的結(jié)果則顯示，bMSCs 組與SH 組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.01），而與NS 組相比則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。建模后3 天、7 天時(shí)，與NS 組相比，腎組織勻漿上清液中，bMSCs 組的IFNγ表達(dá)水平明顯降低（p<0.05），而IL-10 表達(dá)水平則明顯增高（p<0.05）；
　　 在第14 天時(shí)，兩組無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。建模后3 天、7 天、14 天時(shí)，bMSCs 組和NS 組的TGFβ表達(dá)水平較SH 組顯